基于復雜網絡的中醫方劑治療肺癌核心藥物及其干預靶點分析*

喬 陽，劉 震，郭利平△，李 博，任 明

（1. 天津中醫藥大學，天津300193；2. 天津中醫藥大學附屬保康醫院，天津300193）

在過去幾十年中，肺癌一直是世界各個地區癌癥死亡的主要原因，根據中國國家癌癥中心于2018 年2 月發布的數據顯示，肺癌是全國惡性腫瘤發病率以及惡性腫瘤導致死亡人數最高的腫瘤，同時根據2019 年最新發布的美國癌癥統計報告及預測模型顯示，肺癌發病人數是所有新發病例人數第二高的腫瘤，其死亡人數將比因患乳腺癌、前列腺癌、大腸癌以及白血病的死亡人數相加總和更高[1]。盡管新的血液療法和細胞免疫療法有一定進展，但主要的治療方案依舊局限于手術切除以及放化療（ALA 2015），同時并沒有觀察到肺癌患者的預后獲得明顯的改善。

中醫療法常用來改善西醫療法對肺癌患者的副作用，特別是那些接受聯合化療和放療的非小細胞肺癌（NSCLC）的患者。據報道，中醫治療肺癌的機制可能是通過調節肺癌患者的免疫功能，增強T 細胞遷移活動，抑制腫瘤細胞的增殖和促進腫瘤細胞凋亡等途徑[2-4]。

在既往的研究中我們發現，中醫藥療法可有效提高肺癌生存周期，對肺癌具有一定靶向效應和確切的療效，許多肺系疾病經典方劑對肺癌的治療有明顯作用，如玉屏風散、四君子湯等。有研究表明，通過服用四君子湯可有效緩解肺癌癥狀，改善患者生活質量[5]。治療肺癌的中藥方劑使用藥物廣泛博雜，然而其配伍規律以及核心藥物尚不明確，同時既往對肺癌治療方藥的數據挖掘研究多從中醫治療“理法方藥”的層面上分析藥物和使用依據，缺乏從分子生物學層面上對肺癌治療方藥干預靶點的討論。故本文擬基于近20 年中醫治療肺癌的臨床文獻，通過復雜網絡的方法篩選治療肺癌的中藥方劑中的核心藥物，并結合中藥網絡藥理學數據庫提供模型進行核心藥物干預靶點預測，最后利用TCGA 腫瘤高通量基因組數據庫驗證關鍵干預靶點對肺癌患者生存期的影響。

1 材料與方法

1.1 數據采集

1.1.1 文獻來源 文獻檢索采用計算機檢索，限定語種為中文，檢索數據庫包括主要中文期刊文獻數據庫，包括中國知網（CNKI）、萬方數據知識服務平臺（WANFANG DATE）、維普中文期刊服務平臺（VIP）等。檢索策略使用主題詞檢索，其中疾病主題詞包括“肺癌”“肺腫瘤”“小細胞肺癌”“非小細胞肺癌”“鱗癌”“肺腺癌”“肺大細胞癌”，治療主題詞限定為“中藥”“中藥方劑”，兩部分主題詞之間以“And”連接。檢索年限均限定為1997-2017 年近20 年相關文獻。

1.1.2 文獻納入標準 ①研究對象選擇國內所有中藥治療肺癌的臨床研究全文文獻；②診斷標準為《2015 年肺癌診療指南》明確診斷為“肺癌”的患者；③采用中藥治療為主，可合并其他常規腫瘤治療療法；④方劑配伍屬于《中醫內科學》范疇，且效果確切；⑤明確給出方劑處方，中藥選擇包括草本、金石、羽翎、走獸等綱目。

1.1.3 文獻排除標準 ①根據“孤證不立”的原則，排除樣本數＜10 的專家經驗或個案報導文獻；②綜述、Meta 分析及機制研究等類型論文；③診斷不明確，或臨床癥狀表現與“肺癌”診斷標準不符；④重復發表的文獻，僅納入一次；⑤會議論文或專家通信。

1.1.4 數據規范處理與挖掘 中藥名稱規范處理：本研究中，藥物名稱存在曾用名、通俗名、口語名等情況者均以《中華藥典》[6]為標準修訂規范。

中藥處方規范處理：雙人執行納排標準并進行處方提取，對于符合標準的潛在相關文獻獲取其全文，所有有爭議的文獻經雙人討論或請教第三人。

1.1.5 數據挖掘方法 數據庫建立：采用Microsoft Excel 建立“中藥方劑治療肺癌數據庫”，建立數據庫基本條目，包括：題目、第一作者、方劑名稱、中藥名稱、性味、歸經等內容。

關聯分析：使用專業數據挖掘軟件“IBM SPSS MODELER 18.0”版本進行關聯分析，作為經典的關聯規則算法之一，Apriori 算法中包含兩則重要定義即支持度（Support）與置信度（confidence）。支持度與置信度分別反映此關聯規則的有效性和確定性，就中藥A 與中藥B 的關聯規則而言：支持度即為同時出現中藥A 和中藥B 的概率，用以描述中藥間關聯規則的頻度，是對關聯規則重要性的度量。置信度是使用中藥A 的基礎上再使用中藥B 的概率，用以描述中藥間關聯規則的強度，是對關聯規則準確性、可靠性的度量[7]。在本研究中均選取置信度≥10 的中藥配伍作為可信配伍。

1.1.6 復雜網絡的構建 使用Gephi 軟件進行復雜網絡分析，該軟件使用主要包括3 個步驟，即點與邊的輸入、拓撲構圖、網絡分析。

①點與邊的輸入：在本研究中，復雜網絡的點即中藥名稱，邊即通過Apriori 算法計算所得中藥—中藥支持度；

②拓撲構圖：拓撲構圖為可視化工作最重要的內容之一，本研究中選擇的構圖模式為Fruchterman Reingold 模式，即“重力離心”構圖模式，將連接密度大的節點置于圖形中央，節點的位置隨重要程度逐漸由內向外離散；

③網絡分析：通過復雜網絡分析法篩選出其中重要的節點，故選擇度（Degree）與中介性（Betweenness centrality）兩指標作為衡量節點重要程度的量化參考，其中度為某個節點連接的邊的總數目，該參數的意義在于衡量某個節點與其他節點直接聯系的能力，度高的節點稱為度中心，代表其位于整個網絡的直觀核心位置，中介性反映了節點在網絡拓撲結構中所處位置的樞紐程度，將具備高中介中心性的節點稱為中介中心，通過中介節點在網絡中的樞紐特性，可提高節點之間的連接效率，提升網絡的連接特性。

1.2 網絡藥理學機制及關鍵干預靶點預測 核心藥物的網絡藥理學效應以及關鍵干預靶點預測模型來源于中藥方劑網絡藥理學數據庫（BATMAN：http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），該數據庫是第一個專門為研究中藥分子機制而設計的在線生物信息學分析工具，該數據庫可預測每一種中藥成分的潛在靶點，然后對這些目標進行功能分析，包括基因本體（GO）、KEGG 途徑和omim/ttd 疾病濃縮分析。這些功能旨在促進對中醫“多成分、多目標、多途徑”組合治療機制的理解，為今后的實驗驗證提供線索。此外，數據庫還支持用戶同時輸入多味中藥（如成方或自擬方），通常用于同時分析一個方劑可能的多個作用靶點，幫助理解分子和系統層次的藥物組合原理[8]。

1.3 TCGA 腫瘤全基因組數據庫 腫瘤基因組圖譜（TCGA）計劃由美國National Cancer Institute（NCI）和 National Human Genome Research Institute（NHGRI）于2006 年聯合啟動的項目，目前共計研究36 種癌癥類型。其數據來源于癌癥病人自愿捐贈腫瘤組織及正常組織樣本，由人類癌癥生物標本核心資源庫承擔癌癥組織標本和正常組織標本的采集、處理和分配工作，通過高通量測序中心（GSC）分析與各癌癥或者亞型相關的基因突變、擴增或者缺失，包括mRNA 數據、microRNA 數據、Mutation 表現突變數據以及由蛋白芯片測序所得約200 種常見癌癥相關蛋白表達等數據[9]。

2 結果

2.1 檢索結果 檢索流程如圖1 所示，根據文獻檢索策略及納排標準，最終納入符合標準文獻共計244篇，經過人工閱讀提取，共提取肺癌相關中藥方劑306 則。

圖1 檢索流程

2.2 肺癌治療中藥方劑網絡 通過復雜網絡構建肺癌治療中藥方劑網絡（見圖2），從圖中可以看出，黃芪、麥冬、北沙參、白術等藥物為治療肺癌中藥方劑中較重要的藥物。其中，黃芪位于整個模型的核心位置，不僅使用概率最高，也是和其他藥物配伍使用最多的藥物。通過量化網絡節點中心程度的Degree 值和betweenness centrality 值我們也發現，黃芪數值遠高于其他藥物，這表明在肺癌的中藥方劑配伍中不僅可以作為君藥統領諸藥，還可作為臣藥配合其他藥物更好發揮作用。

2.3 黃芪的干預靶點預測 通過中藥方劑網絡藥理學數據庫預測模型分析，利用主成分分析法，結合黃芪的化學成分，我們發現黃芪的提取物能有效干預PLD1 靶點。如圖3 所示，經過GO 分析和KEGG 注釋，發現PLD1 作為許多細胞分化途徑的重要步驟，對包括信號轉導、膜運輸和有絲分裂都起干預作用，并可作為囊泡內的膜運輸核。其主要作用機制是通過刺激磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸，磷酸激酶活化的C-α，通過將ADP-核糖基化因子arf-1（-1）、以及由GTP-結合蛋白的Rho、Cdc42和Rac-1。

圖2 肺癌治療中藥方劑復雜網絡模型及參數

圖3 黃芪潛在干預靶點PLD1 蛋白互作用機制

2.4 PLD1 在肺癌中的干預作用 通過分析TCGA數據庫我們發現，在25 種腫瘤及亞型的橫向對比中，PLD1 在2 種肺癌亞型，包括831 例小細胞肺癌（LUAD）及874 例肺鱗癌（LUSC）中均呈現高表達（見圖4），尤其是在小細胞肺癌中，PLD1 在肺鱗癌組織中的表達是健康肺組織的2 倍以上。同時，根據來源于真實世界臨床病例的482 例小細胞肺癌以及477 例肺鱗癌的生存報告，繪制全生存周期內的生存曲線，結果顯示，PLD1 高表達對于小細胞肺癌的生存周期具有重要影響且具備顯著性差異（HR=1.6，P=0.002），即PLD1 高表達人群在同一個時間節點內死亡幾率是低表達人群的1.6 倍，但在肺鱗癌中我們并未觀察到PLD1 的表達量與生存周期存在明顯相關性。研究結果提示，降低PLD1 的表達對于提高肺癌尤其是小細胞肺癌患者的生存率具有重要意義，但對于肺鱗癌患者可能并無顯著作用。

3 討論

中醫學理論認為“邪之所湊，其氣必虛”，辨證肺癌，多屬氣虛。黃芪性甘溫，歸肺脾經，有補氣壯陽、固表斂汗之效，為傳統補氣之要藥。近年來，有關黃芪在防治腫瘤領域中的研究更是得到了科研人員的熱點關注。研究表明，黃芪化學成分相對復雜，主要包括有多糖、皂苷、黃酮等[10]。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是其主要有效活性成分，在體外對Lewis 肺癌細胞有抑制轉移作用[11]。黃芪多糖不僅能誘發腫瘤細胞凋亡，還可抑制Th1 型細胞因子和轉錄因子的表達，起到調節T 細胞亞群的作用[12]。黃芪甲苷（astragaloside A）作為中藥黃芪的最主要單體活性成分之一，能抑制SPC-A-1 細胞增殖，增加細胞凋亡率[13]。臨床研究發現，黃芪口服液、黃芪注射液，可改善老年肺癌患者的免疫功能，提高生存質量，利于生存期的改善[14-15]。以黃芪為君藥的方劑如黃芪生脈飲、大黃芪湯對非小細胞型肺癌的治療有良好的輔助作用[16-17]。

圖4 PLD1 在肺癌中的表達情況及對生存率的影響

磷脂酶D（phospholipaseD，PLD）是調控機體磷脂代謝的重要酶類[18]，近年研究表明，在多種惡性腫瘤中，PLD 表達和活性增高，并可促進腫瘤的增生和浸潤，PLD 對腫瘤細胞的生存、生長以及侵襲轉移的促進作用主要是通過其酶解產物PA 與信號通路游靶分子的相互作用實現[19]。哺乳類動物常見PLD1 和PLD2 2 種亞型[20]。相關文獻表明，在多種腫瘤組織中均發現PLD1 活性異常升高，如胃癌、肝細胞癌等[21-22]。

肺癌是比較常見的惡性腫瘤之一，我國肺癌發病率處于不斷的攀升趨勢并趨于年輕化[23]，肺癌的發生發展機制及其治療的轉歸和預后是當前研究的熱點之一。有關PLD1 與肺癌尤其是小細胞肺癌的生存周期關系的相關報道并不多見。通過中藥網絡藥理學數據庫以及TCGA 腫瘤全基因組數據庫，通過數據挖掘方法探索預測中藥黃芪能有效的干預PLD1 這個關鍵靶點，并通過大數據高通量全基因組信息觀察調節PLD1 靶點對肺癌患者生存期的影響，為進一步的實驗研究提供了一定的理論依據。