胡桃醌對類風濕關節炎關節成纖維樣滑膜細胞增殖和凋亡的影響

左瑞庭，王西彬

［河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院），河南 鄭州450002］

類風濕性關節炎是一種慢性、多關節性、系統性的自身免疫病，病理改變主要包括滑膜炎癥，關節軟骨和軟骨的破壞等，其中以滑膜炎癥為最主要的病理表現［1-2］。成纖維樣滑膜細胞是構成滑膜組織的主要部分，在類風濕性關節炎滑膜病變中表現為異常活化增殖［3-4］，成纖維樣滑膜細胞增殖和凋亡的失衡與類風濕性關節炎的形成關系密切［3］。因此，抑制類風濕關節炎關節成纖維樣滑膜細胞（RA-FLSs）增殖并促進其凋亡對防治類風濕性關節炎具有重要意義。

胡桃醌是胡桃楸和核桃中存在的重要活性物質，具有明確的抗腫瘤作用，此外，還具有抗菌、抗炎、殺蟲等藥理作用［5-7］。胡桃醌具有顯著調節細胞增殖的作用，如抑制成膠質細胞瘤細胞和宮頸癌細胞增殖，促進皮膚細胞增殖等［8-9］，可促進宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤等細胞的凋亡［10-12］。然而，目前為止還沒有胡桃醌與RA-FLSs的增殖和凋亡之間關系的相關報道，故本實驗對此進行研究。

1 材料

RA-FLSs 細胞株購自歐洲動物庫。DMEM 高糖培養基和胎牛血清購自美國HyClone 公司；Akt 兔單克隆抗體、p-Akt 兔單克隆抗體（phospho S473）、p21 兔單克隆抗體、GAPDH 兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；BCA 試劑盒購自美國Pierce 公司；硝酸素纖維膜購自美國Promega 公司；MTT 購自上海生工公司；Annexin-V FITC／PI 試劑盒購自美國PharMingen 公司；BrdU 試劑盒購自美國Sigma 公司；SC79 購自碧云天公司。

2 方法

2.1 RA-FLSs 培養 RA-FLSs 由含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養基于5%CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養，待細胞融合度達80%即可傳代。

2.2 Annexin-V FITC／PI 檢測細胞凋亡 利用Annexin-V FITC／PI 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡，并按照試劑盒說明書進行。首先用磷酸鹽緩沖溶液預冷細胞，然后用Annexin-V FITC（13 μL）于4 ℃孵育細胞28 min，PBS 洗細胞1 次，加入10 μL PI 孵育7 min，最后用流式細胞分析儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3 次。

2.3 caspase-3 活性檢測 收集細胞，按照試劑盒（BD ApoAlert Caspase-3 Fluorescent Assay Kit）說明書檢測caspase-3 活性，記錄結果。實驗重復3 次。

2.4 MTT 法檢測細胞活力 將RA-FLSs（5×104／孔）接種于96 孔板，不同濃度胡桃醌或Akt 激動劑處理，于5%CO2、37 ℃培養24 h 后，進行MTT 實驗檢測。首先，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）繼續培養5 h，去掉上清后每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩溶解結晶甲瓚15 min，酶標儀測定溶液在490 nm 波長處的吸光度，結果為3 次重復試驗的平均值。

2.5 BrdU 檢測 利用BrdU 試劑盒檢測細胞增殖，按照說明書進行操作。將RA-FLSs（5×104／孔）接種于96 孔板，不同濃度胡桃醌或Akt 激動劑處理后（對照組無胡桃醌和Akt 激動劑處理），于5%CO2、37 ℃培養24 h，每孔加入10 μL BrdU 后孵育1 h，輕輕去掉上清液，每孔加入變性溶液100 μL，孵育20 min 后，按照說明書相繼加入BrdU 抗體和二抗，最后加入四甲基聯苯胺（TMB）孵育25 min，酶標儀檢測370 nm 波長處的吸光度以反映細胞增殖的變化。每組樣品3 個復孔，每次實驗重復3 次。

2.6 Western blot 檢測 收集細胞，提取蛋白，利用BCA 試劑盒定量蛋白，將25 μg 蛋白于聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，半干法轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉膜2 h，一抗［Akt兔多抗（1∶ 500）、p-Akt 兔單抗（1∶ 500，phospho S473）、p21 兔單抗（1∶800）、GAPDH兔單抗（1∶1 000）］4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育1.5 h，利用凝膠成像系統觀察結果，GAPDH 為內參對照蛋白。實驗結果為3 次重復的平均值。

2.7 統計學分析 采用SPSS21.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示。2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 胡桃醌對RA-FLSs 增殖的作用 與0 μmol／L胡桃醌比較，胡桃醌濃度為（30、40、50 μmol／L）時顯著抑制RA-FLSs 的細胞活力和增殖能力（P＜0.01）。見圖1。

3.2 胡桃醌對RA-FLSs 凋亡的作用 與0 μmol／L胡桃醌比較，胡桃醌濃度為（30、40、50 μmol／L）顯著促進RA-FLSs 凋亡，并顯著促進caspase-3 活性（P＜0.01）。見圖2。

3.3 胡桃醌對Akt 活化和p21 蛋白表達的調節作用 與0 μmol／L 胡桃醌比較，30 μmol／L 胡桃醌能顯著抑制p-Akt 蛋白表達，促進p21 蛋白表達（P＜0.01）。見圖3。

圖1 胡桃醌對RA-FLSs 增殖的影響Fig.1 Effects of juglone on the proliferation of RA-FLSs

圖2 胡桃醌對RA-FLSs 凋亡的影響Fig.2 Effects of juglone on the apoptosis of RA-FLSs

圖3 胡桃醌對Akt 活化和p21 表達的影響Fig.3 Effects of juglone on the Akt activation and p21 expression

3.4 胡桃醌通過調節Akt 磷酸化來調控p21 蛋白表達 與胡桃醌（30 μmol／L）比較，胡桃醌（30 μmol／L）和SC79（1.0、1.5、1.8 μg／mL）共同處理能顯著促進Akt 磷酸化（P＜0.01），胡桃醌（30 μmol／L）和SC79（1.0 μg／mL）共同處理后p21 蛋白表達顯著下降，顯著抑制細胞凋亡，增殖能力顯著升高（P＜0.01）。見圖4。

4 討論

類風濕性關節炎是常見的全身性自身免疫性疾病，主要侵犯關節滑膜，嚴重者可致關節變形，心、肺、腎等臟器也可受累［13］，其分布廣，病程長，反復發作，具有發病率、致殘率高的特點［14］。成纖維樣滑膜細胞大量增生是類風濕關節炎發生的中心事件，在其病理機制中起關鍵作用［13］。胡桃醌屬于萘醌類，是胡桃科植物胡桃及黑核桃中的重要活性物質，具有抗炎、抑菌和抗腫瘤的作用［15］，研究表明，它對細胞增殖能力具有調控作用；Wahedi 等［8］報道胡桃醌具有促進皮膚細胞增殖的作用，促進傷口愈合；Wang 等［16］研究發現胡桃醌可有效抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖和遷移；Hu等［17］報道表明胡桃醌對乳腺癌細胞系MCF7Adr 的增殖和侵襲能力具有抑制作用；Zhang 等［18］證實胡桃醌可誘導宮頸癌細胞系SiHa 的凋亡過程。在甲狀腺低分化癌的細胞中，胡桃醌顯著促進其凋亡［19］；同時，胡桃醌對肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞和黑色素瘤細胞的凋亡也具有誘導作用［12，20］，然而，目前為止仍沒有研究表明胡桃醌對成纖維樣滑膜細胞的增殖和凋亡是否有作用。本實驗利用不同濃度胡桃醌孵育RA-FLSs 24 h，結果表明胡桃醌濃度為30 μmol／L 時顯著抑制RA-FLSs 細胞的生長活力和增殖能力，同時顯著促進RA-FLSs 細胞的凋亡，說明它可有效抑制RA-FLSs 增殖且促進其凋亡。

圖4 胡桃醌調節RA-FLSs 增殖和凋亡的相關分子機制Fig.4 Molecular mechanisms of regulation of RA-FLSs proliferation and apoptosis by juglone

有報道表明，胡桃醌在乳腺癌細胞SKBR3 中可抑制Akt 的活化［21］；Li 等［22］發現抑制Akt 活性可促進血管平滑肌細胞中p21 的表達。Akt 又稱為蛋白激酶B（PKB），是細胞增殖和凋亡的重要調控因子［23］，激活后具有促進骨肉瘤細胞、海馬神經元和膽囊癌細胞增殖的能力［24-25］，Akt 活性被抑制后，誘導肝星狀細胞和胃腸道間質瘤細胞［26-27］。p21 是已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白，參與細胞的生長、分化、衰老及死亡過程［28］，Audo 等［29］發現p21 可誘導RA-FLSs 細胞的凋亡，p21 的下調推動細胞周期進程，導致RAFLSs 增殖［30］，但目前仍無研究表明RA-FLSs 中胡桃醌、Akt 和p21 之間的調控關系。本實驗中胡桃醌（30 μmol／L）與不同濃度Akt 激動劑SC79 同時 孵育RA-FLSs 24 h 后顯示，SC79 濃度為1.0 μg／mL時，p21 蛋白表達較胡桃醌（30 μmol／L）孵育RA-FLSs 24 h 顯著降低，表明胡桃醌可通過調節Akt 活性來調節p21 蛋白表達；胡桃醌（30 μmol／L）與SC79（1.0 μg／mL）同 時 孵育RA-FLSs 24 h 后，細胞凋亡率降低、增殖能力升高較胡桃醌（30 μmol／L）孵育RA-FLSs 24 h 明顯，表明在RA-FLSs 中胡桃醌可通過調節p21 蛋白表達來調控細胞增殖和凋亡，與文獻報道p21 對RAFLSs 增殖和凋亡的作用一致［29-30］。因此，胡桃醌可通過Akt 來調節p21 蛋白表達，進而抑制RAFLSs 增殖和促進其凋亡。

綜上所述，胡桃醌具有抑制RA-FLSs 細胞增殖和促進其凋亡的作用，并可通過調控Akt 磷酸化調節p21 蛋白表達。胡桃醌對p21 的調節實現了它對RA-FLSs 增殖和凋亡的調控作用，可為治療類風濕關節炎提供更多的參考。