獨活寄生湯對改良Hulth法造模大鼠膝骨關節炎軟骨形態的影響

趙忠勝 ，黃云梅 ，鄭若曦 ，邱建清 ，劉淑如 ，吳廣文

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）多見于中老年人，是最常見的骨關節炎類型。隨著人口老齡化及肥胖人口增加，其發病率逐年增加［1-2］。膝骨關節炎易反復發作，纏綿難愈，具有較高的致殘率。KOA以軟骨退變、滑膜炎癥、骨贅形成、軟骨下骨硬化等為主要病理特征［3］，其確切病因及發病機制尚不明確。目前的治療方法以對癥治療為主，仍未找到能夠延緩KOA進展的有效方法［4］。早期進行干預預防可延緩關節軟骨退變、修復軟骨損壞，對防治KOA的進一步發展有重要意義［5-6］。獨活寄生湯作為中藥復方，具有扶正祛邪、標本兼顧的特點，能有效緩解KOA患者的臨床癥狀。研究表明：獨活寄生湯能抑制軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變，但其效應的作用機制有待深入研究［7-8］。本研究觀察獨活寄生湯對改良Hulth法造模大鼠膝骨關節炎軟骨形態的影響，從形態學角度探討其作用機制，為其臨床運用提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級2月齡雄性SD大鼠66只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司［合格證號：SCXK（滬）2017-0005］提供。動物處理方法符合中華人民共和國科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 實驗藥物 獨活寄生湯藥物組成：獨活9 g，桑寄生 6 g，牛膝 6 g，杜仲 6 g，秦艽 6 g，防風 6 g，肉桂 6 g，細辛 6 g，當歸 6 g，川芎 6 g，熟地黃 6 g，芍藥 6 g，人參 6 g，茯苓 6 g，甘草 6 g；鹽酸氨基葡萄糖膠囊（香港澳美制藥廠）；均購于福州市閩侯縣上街致誠醫藥商店。

1.3 實驗藥液制備 獨活寄生湯藥液按照大鼠數量、體質量，計算出用藥量，加入蒸餾水煎煮的藥液，濃縮至濃度為0.93 g／mL，-20℃保存備用。鹽酸氨基葡萄糖膠囊用蒸餾水配制，濃度為0.15 g／mL，4℃冰箱保存備用。

1.4 實驗儀器與試劑 BioSpec 70／20 USR小動物核磁共振成像儀（瑞士布魯克公司）；RM2265石蠟切片機、DM4000B研究級生物顯微鏡（德國徠卡儀器公司）；Moticam5000c＋Motic M形態學顯微圖像采集與分析系統（廈門市麥克奧迪實業集團有限公司）；改良番紅O-固綠軟骨染色液（北京Solarbio生物技術有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模 大鼠適應性喂養1周，采用隨機數字表法分為正常組18只和造模組48只。采用改良Hulth法造模：大鼠膝關節內側入路，切斷內側副韌帶、前交叉韌帶，摘除內側半月板［9］。術后連續3 d肌肉注射青霉素20萬U預防感染。手術傷口愈合后開始每天強迫大鼠活動0.5 h，連續2周。

2.2 大鼠膝關節MRI掃描 大鼠造模強迫運動2周后，隨機抽取正常組、造模組大鼠各3只，拍攝膝關節MRI，觀察膝骨關節炎進展情況。采用氣體（異氟烷與氧氣混合，比例1∶4）麻醉裝置對大鼠進行持續麻醉，掃描過程中實時監測大鼠生命體征。將大鼠仰臥位固定于檢查板，膝伸直輔以軟墊固定，環形表面線圈固定于關節正上方，線圈中心正對脛骨平臺，采用冠狀位和矢狀面T2WI序列進行成像。T2WI序列采用TurboRARE序列，參數如下：TR＝4 554.863 ms，TE＝35.0 ms，層厚 0.4 mm，矩陣 256×256，FOV 30×20 mm2，掃面層數 13 層，平均次數4 次，掃描時間 9 min、43 s、22 ms。

2.3 干預 造模結束后，抽簽法將造模組隨機分為3組，即模型組、對照組和治療組各15只。根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算［10］，灌胃給藥12周，2周1個療程，每個療程間隔2 d。正常組和模型組按 10 mL／（kg·d）給予 0.9%NaCl溶液灌胃；對照組按 0.15 g／（kg·d）給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊灌胃；治療組按 0.93 g／（kg·d）給予獨活寄生湯灌胃。

2.4 取材 灌胃結束后，采用2%戊巴比妥鈉溶液按2 mL／kg的劑量麻醉大鼠，切取左側脛骨平臺內側軟骨組織。標本置于4%多聚甲醛中固定48 h后，用10%EDTA-2Na脫鈣液中脫鈣8周，每3天換1次脫鈣液。組織標本修切后，常規石蠟包埋。

2.5 軟骨組織HE染色與Mankin評分 組織切片常規脫蠟至水后，蘇木素染色10 min，蒸餾水漂洗1 min，1%鹽酸酒精分色3 s，自來水洗，返藍15 min；伊紅染色3 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察軟骨組織形態結構。各組軟骨組織HE染色后，每張切片選取5個不同視野，參照Mankin關節軟骨病理評分標準［11］，從軟骨結構、軟骨細胞狀態、基質染色、潮線的完整性等方面進行評分。

2.6 番紅O-固綠染色與OARSI評分 組織切片常規脫蠟至水后，在新配制Weigert染色液（A1∶A2＝1∶1）中浸染 5 min，酸性分化液分化 15 s，蒸餾水洗10 min，固綠染色液內浸染5 min，快速用弱酸溶液洗滌15 s以去除殘留固綠，番紅O染色液浸染7 min，分別用95%、100%酒精脫水，二甲苯透明，干燥，封片，鏡下觀察軟骨組織形態結構。番紅O-固綠染色后，每張切片選取5個不同視野，參照OARSI關節病理評分標準［12］，從蛋白多糖丟失、軟骨丟失、縱裂或糜爛、病變到達鈣化軟骨等方面進行評分。

2.7 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態分布以中位值（第一四分位數，第三四分位數）表示，組間比較采用秩和檢驗。

3 結 果

3.1 實驗動物死亡情況 在實驗過程中，模型組因麻醉意外致死1只，灌胃過程因肺栓塞致死1只；治療組灌胃過程因腹瀉致死1只；對照組灌胃過程因肺栓塞致死1只。最終共56只進入結果分析。

3.2 大鼠膝關節MRI 正常組可見關節間隙正常，內外側半月板結構完整，股骨髁和脛骨平臺關節面平整。造模組關節間隙增寬，內側半月板缺如，關節軟骨面不平整、軟骨層變薄、局部缺損，結締組織增生，骨贅形成，關節腫脹積液明顯。見圖1。

圖1 大鼠膝關節MRI影像圖

3.3 關節軟骨HE染色 正常組關節軟骨表面平整，四層結構清晰，無裂隙或中斷，細胞排列整齊，基質染色均勻，潮線完整。模型組軟骨表面粗糙、碎裂或缺失，裂隙深達輻射層，軟骨細胞排列混亂，基質染色不均勻，潮線破壞，軟骨下骨增生明顯。對照組關節軟骨表面不規整，軟骨層變薄，局部有表淺裂隙，軟骨細胞部分缺失，局部細胞增生，基質染色不均勻，潮線尚完整，軟骨下骨結構紊亂。治療組關節軟骨表面不規則，層次完整，軟骨細胞彌漫性增生，排列輕度紊亂，潮線完整，軟骨下骨無明顯改變。見圖2。

3.4 關節軟骨番紅O-固綠染色 番紅O是堿性染料，與硫酸軟骨素、硫酸角質素等酸性蛋白多糖結合，將軟骨基質染成紅色；固綠是酸性染料，與富含堿性氨基酸的膠原纖維結合，將軟骨淺表層、軟骨下骨染成綠色。正常組可見軟骨基質紅染，顏色鮮艷，固綠將淺表層、軟骨下骨染成綠色。模型組番紅O染色中重度減弱，部分失染；局部地方細胞增生、肥大，細胞數量增多。對照組和治療組經干預后，均較模型組改善，番紅O染色增強，染色變深，表明治療后蛋白多糖表達上升，治療組較對照組改善更明顯，染色更深，說明治療組療效優于對照組。見圖3。

圖2 關節軟骨HE染色圖（×100）

圖3 關節軟骨番紅O-固綠染色圖（×100）

3.5 4組軟骨組織Mankin評分、OARSI評分比較見表1。

表1 4組軟骨組織Mankin評分、OARSI評分比較（） 分

表1 4組軟骨組織Mankin評分、OARSI評分比較（） 分

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01；與對照組比較，3） P＜0.01。

組別正常組模型組對照組治療組n 15 13 14 14 Mankin評分0.33（0.00，0.83）11.28±1.271）8.92±1.682）6.58±1.562）3）OARSI評分0.33（0.00，0.83）5.27±0.791）4.58±0.792）3.00±0.852）3）

4 討 論

骨性關節炎發病機制非常復雜，是眾多因素相互作用的結果。KOA發生發展不僅是關節軟骨基質分解與合成代謝的失衡，還是全身衰老性改變的局部反應［10］。 軟骨的退變是 KOA 的基本病變［13-14］，軟骨表面的膠原纖維退化，使軟骨負荷面變薄，粗糙不平，軟骨的深層發生裂隙。關節受力異常，關節軟骨磨損刺激關節滑膜和軟骨細胞出現炎癥反應，繼發滑膜組織增生、關節積液和軟骨營養障礙［10，13］。磨損導致局部軟骨消失和外圍軟骨的增生，骨贅形成，加重關節畸形和破壞，導致軟骨下骨外露、硬化、囊變及關節間隙的變窄［15-16］。模型的選擇與建立是研究KOA病理機制及防治的必要手段，誘發動物KOA模型可通過關節機械制動、手術改變關節應力、破壞關節局部血液循環、藥物關節腔內注射等多種方法。本實驗采用與DMM造模法類似的改良Hulth 法造模［9，17］，一方面，膝關節內翻，力學軸線改變，負重力線內移，關節面緩沖力較低，形成應力集中而繼發骨小梁微骨折、骨質塌陷；另一方面，膝關節穩定性降低，脛股關節面軟骨磨損，引起軟骨退變；加之造模后，強迫大鼠運動，加速KOA形成。

大鼠造模1個月后膝關節MRI顯示：關節軟骨變薄、缺損，關節腔內積液，表明經改良Hulth法造模后，大鼠膝關節已向骨關節炎發展，出現骨關節炎的早期病理表現。干預后HE染色、番紅O－固綠染色結果顯示，模型組軟骨退變、破壞等；正常組Mankin評分明顯低于模型組，表明改良Hulth法造模4個月后，大鼠膝關節已出現骨關節炎的中晚期病理表現。綜合對比正常組與模型組實驗結果，表明改良Hulth法是誘發大鼠KOA理想的造模方法，與KOA發病機制相符，貼近臨床實際，是一種理想合理的造模方法。

膝骨關節炎屬“痹痛”“骨痹”范疇，以虛為本，以痰、瘀之實為標，屬本虛標實、本痿標痹之證［18］。KOA的治療以控制疼痛、延緩軟骨退變、改善關節功能為目標。早期KOA以保守治療為主，旨在延緩病情進展；中晚期KOA以手術治療為主，配合保守治療，旨在緩解疼痛，改善關節功能，提高生活質量。對于早期KOA的治療，中醫藥有良好的臨床療效。獨活寄生湯具有補肝腎、益氣血、祛風濕、止痹痛之效。現代藥理學、臨床應用研究表明，獨活寄生湯具有抗炎鎮痛、改善微循環、延緩軟骨退變等作用［5，19-20］，廣泛應用于骨性關節炎、腰椎間盤突出癥等骨科疾病。關于其治療KOA的機制，仍在進一步探索之中。

本研究在應用改良Hulth法誘發大鼠KOA模型的基礎上，觀察獨活寄生湯對KOA大鼠關節軟骨形態的影響，從形態學角度探究獨活寄生湯治療KOA的機制。治療結束后，模型組取材后肉眼觀察示：關節周圍滑膜、韌帶等結締組織增生明顯，關節間隙變窄，軟骨被大量增生組織包裹，軟骨表面蒼白不平整；形態學染色示：淺表層毛糙，局部缺損，軟骨細胞增生、肥大，細胞數量增多，軟骨下骨結構紊亂、增生，說明改良Hulth法造模后，大鼠膝關節軟骨及軟骨下結構病變嚴重，病變累及軟骨層及軟骨下骨。治療組取材后肉眼觀察示：關節周圍滑膜、韌帶等結締組織增生較輕，軟骨表面有血色、較平滑；形態學染色示：軟骨表面較平滑，軟骨細胞數量增多，排列較規則、整齊，軟骨基質中蛋白多糖含量增加。治療組病理變化明顯較模型組輕，說明獨活寄生湯在一定程度上可以抑制軟骨退變，以維持軟骨結構的完整性；促進軟骨細胞及基質分解與合成代謝，以促進軟骨細胞增殖，增強軟骨修復功能，從而有效抑制KOA的進展。