蠐螬提取物對實(shí)驗(yàn)性兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞HGF、VEGF表達(dá)的影響※

●梁凱霞 蔣鵬飛 彭 俊 彭清華,3▲

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)發(fā)病率較高，多發(fā)于50～70歲中老年人，發(fā)病率無明顯性別差異，常單眼發(fā)病，以視網(wǎng)膜靜脈怒張迂曲為特征，受累靜脈區(qū)域有廣泛的出血、滲出或水腫。新生血管(CNV)是RVO的常見并發(fā)癥，治療困難，嚴(yán)重影響視功能，約15%的患者并發(fā)新生血管性青光眼。

蠐螬具有破瘀、散結(jié)、止痛、解毒之功，《藥性論》言其“汁滴目中，去翳障，主血，止痛”。因此，蠐螬常用于目疾的治療。前期研究發(fā)現(xiàn)蠐螬提取物可促進(jìn)RVO出血的吸收、抑制CNV的形成[1-2]，但具體作用機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步探討蠐螬抑制CNV的作用機(jī)制，本文觀察了蠐螬提取物對RVO模型HGF、VEGF表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取40只體重為1.8～2.3kg的健康實(shí)驗(yàn)性兔，不限雌雄(動(dòng)物許可證號(hào)：湘醫(yī)動(dòng)字第30-015號(hào))。

1.2主要實(shí)驗(yàn)藥品和試劑蠐螬提取物(參考陽長明的方法[3]制備)；復(fù)方血栓通片；0.4%倍諾喜滴眼液；兔抗HGF多克隆抗體、兔抗VEGF多克隆抗體(均由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器裂隙燈顯微鏡(蘇州六六視覺科技有限公司，型號(hào)：YZ5S)；YZZOT型顯微鏡(蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠)；PCR儀(德國Biometra)；Mias-2000圖形分析系統(tǒng)(四川川大智勝軟件股份有限公司)；Leica石蠟切片機(jī)(徠卡，型號(hào)RM2235)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只實(shí)驗(yàn)性兔隨機(jī)分為空白組、模型組、復(fù)方血栓通組、蠐螬提取物組4個(gè)組，每組均為10只動(dòng)物。

2.2造模方法模型組、復(fù)方血栓通組、蠐螬提取物組動(dòng)物應(yīng)用光化學(xué)動(dòng)力法[4]制作實(shí)驗(yàn)性RVO模型，具體操作為：雙眼散瞳后，麻醉動(dòng)物，將動(dòng)物頭固定于裂隙燈前，安置三面鏡，以裂隙燈顯微鏡觀察動(dòng)物眼底，激光器指示光斑定位于視盤邊緣的靜脈后，自動(dòng)物耳緣靜脈緩慢推入20%熒光素鈉注射液(0.3mL/kg)，30s內(nèi)推完，注藥后用激光照射雙側(cè)視網(wǎng)膜靜脈，同時(shí)注意避開伴行的動(dòng)脈，遠(yuǎn)端靜脈有明顯的擴(kuò)張時(shí)即為造模成功。

2.3動(dòng)物給藥方法空白組、模型組以蒸餾水5mL/kg灌胃；復(fù)方血栓通組以復(fù)方血栓通0.1g/kg溶于蒸餾水中制成混懸劑，5mL/Kg灌胃；蠐螬提取物組以蠐螬提取物0.56g/100g灌胃。每日1次，持續(xù)至動(dòng)物取材。于造模后1wk、3wk每組各隨機(jī)處死5只動(dòng)物取材。

2.4取材方法將實(shí)驗(yàn)性兔耳緣靜脈注射空氣處死后，摘除兩只眼球，在手術(shù)顯微鏡下去除眼前節(jié)及玻璃體等多余組織，剝離激光斑部位視網(wǎng)膜，酒精脫水，石蠟包埋，切片，烘干備用。

2.5測試檢測將取材的切片行蘇木精-伊紅染色，做免疫組化組織學(xué)檢測HGF與VEGF表達(dá)，每張切片均選取免疫組化陽性染色最多的4個(gè)視野框，用Mias-2000圖形分析系統(tǒng)測量視野框內(nèi)HGF與VEGF的平均光密度，在光學(xué)顯微鏡下主要觀察視網(wǎng)膜組織變化。

3 結(jié)果

造模后1wk：空白組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，HGF與VEGF少量表達(dá)于視網(wǎng)膜，與模型組、復(fù)方血栓通組、蠐螬提取物組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組視網(wǎng)膜組織水腫，細(xì)胞排列較亂，尚無新生血管索，HGF與VEGF大量表達(dá)于視網(wǎng)膜，與復(fù)方血栓通組、蠐螬提取物組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)方血栓通組、蠐螬提取物組視網(wǎng)膜組織水腫，細(xì)胞排列紊亂，HGF與VEGF少量表達(dá)于視網(wǎng)膜，兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后3wk：空白組HGF與VEGF表達(dá)與造模后1wk時(shí)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組出現(xiàn)大量的新生血管索，但HGF與VEGF表達(dá)與造模后1wk時(shí)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)方血栓通組、蠐螬提取物組視網(wǎng)膜組織水腫減輕，無新生血管索，HGF與VEGF表達(dá)均較造模后1wk下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組視網(wǎng)膜組織光鏡圖(HE，×400)

注：①-⑦分別表示空白組、模型組給藥后1周、模型組給藥后3周、復(fù)方血栓通組給藥后1周、復(fù)方血栓通組給藥后3周、蠐螬提取物組給藥后1周、蠐螬提取物組給藥后3周視網(wǎng)膜HE染色。

表1 各組HGF與VEGF陽性表達(dá)的平均光密度值

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較：◇P<0.05；與1wk時(shí)比較：▲P<0.05。

4 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生后，血液回流障礙，視網(wǎng)膜代償性形成新生血管[5-7]，新生血管管壁僅有一層細(xì)胞構(gòu)成，極易發(fā)生出血[8-9]，引起視力下降，持續(xù)的出血會(huì)對視網(wǎng)膜造成毒性損傷[10-11]。現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為蠐螬能夠治療RVO所致的視網(wǎng)膜病理損傷[1-2]。

視網(wǎng)膜靜脈阻塞屬祖國醫(yī)學(xué)“絡(luò)瘀暴盲”范疇，《銀海精微·腎經(jīng)主病》認(rèn)為本病病機(jī)為“屬相火上浮，水不能制。”《銀海指南·血病論》曰：“目得血而能視，血者氣之所化也。故血盛則形強(qiáng)，人生所賴，惟斯而已。潤經(jīng)絡(luò)，澤臟腑，養(yǎng)筋骨，充滿一身，而目受其蔭，固宜通疏，而不宜淤滯者也。”本病的發(fā)生與血液瘀滯密切相關(guān)，而蠐螬有活血化瘀之功，切中本病病機(jī)。

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)最先從肝臟部分切除的鼠血清中分離出來，而后從鼠的血小板、肝臟及人的血清中分離出來，所以命名為肝細(xì)胞生長因子[13]。在眼部，HGF可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，刺激眼內(nèi)多種細(xì)胞組織的生長和移行。多項(xiàng)研究[13-15]均說明HGF確實(shí)能介導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)新生血管生成[16]。

本研究結(jié)果顯示：模型組HGF、VEGF表達(dá)較空白組明顯上調(diào)，復(fù)方血栓通組與蠐螬提取物組較模型組均有不同程度降低，但復(fù)方血栓通組與蠐螬提取物組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，兩組的CNV產(chǎn)生均少于模型組，提示復(fù)方血栓通組、蠐螬提取物組是通過下調(diào)HGF、VEGF以抑制CNV的發(fā)生。本研究也存在不足之處，如未將蠐螬按劑量分為不同組別，蠐螬對HGF與VEGF的抑制作用是否與劑量有關(guān)仍不得而知。如能進(jìn)行深入研究，則有望為臨床尋找療效更佳、價(jià)格更低廉的藥物，創(chuàng)造更大的社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益。