中草藥對森林腦炎小鼠腦中TLR/TRIF通路基因表達的影響

張瑜

(黑龍江中醫藥大學臨床醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著近年來地球氣候變暖森林腦炎在有不斷擴大流行的趨勢，目前，森林腦炎的治療藥物主要有地塞米松、利巴韋林和干擾素等，這些藥物雖都有抗菌消炎的作用，但如果長期、大劑量應用，則會引起各種不良反應和停藥反應[1]。有研究表明，復方中藥對森林腦炎具有良好的治療效果，但其治療機制還不明確[2]。因此，本實驗依據我國傳統醫學臨床經驗和現代醫學研究成果，選擇苦參、訶子、川楝子、梔子、紫花地丁等中藥組方對感染森林腦炎病毒的小鼠進行治療，對其腦組織中炎性因子的含量進行測定，并對腦組織中介導炎性反應的TLR/TRIF信號通路中相關基因的表達進行分析，對復方中藥是如何降低炎癥損傷，發揮其對腦組織的保護作用的途徑和機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病毒液的制作和收集

將森林腦炎病毒液加入地鼠腎傳代細胞培養瓶中，加入病毒液后慢慢晃動混勻，保證病毒液充分接觸并感染細胞后，將培養瓶37℃培養90 min。每天觀察細胞，當超過90%細胞病變并有細胞脫落時收獲細胞病毒液，然后反復在-80℃、-37℃條件下反復凍融細胞，充分釋放病毒于細胞培養液中，無菌條件下1 000 rpm，離心10 min，收集上清液，分裝備用。

1.1.2 感染小鼠模型的制作

選取清潔級21日齡雄性小鼠，體質量(18±1)g，制作模型前禁食12 h，禁水6 h。將小鼠麻醉后，在小鼠眼后角、耳前緣、顱中線所構成的三角形中點部位，將微量注射器抽取好的病毒懸液20 μL垂直進針3～5 mm，將病毒液緩慢推進鼠腦，注毒結束后待病毒液完全吸收后再快速將針頭拔出，以免未被腦組織完全吸收的病毒液流出。采用RT-PCR技術檢測實驗小鼠血清中森林腦炎病毒的RNA片段，以鑒定動物模型制作的成功。

1.1.3 復合中藥

復合中藥由苦參、訶子、川楝子、梔子、紫花地丁等5味藥材飲片由黑龍江省中醫藥大學提供，經50℃烘干、粉碎后過40目篩制成原粉。苦參、訶子、川楝子、梔子、紫花地丁原粉按4∶2∶2∶2∶1的比例組方，加水煎煮2次，每次煎煮90 min，取過濾后藥汁混合，濃縮藥汁,使1 mL的藥液相當于1 g的藥粉，以濃縮藥汁為實驗藥液。

1.2 實驗設計與分組

選取12只健康小鼠作為空白組，另選取48只模型小鼠隨機分為模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、每組各12只。各組具體處理方法如下,空白組：動物正常飼養，顱內注入與病毒液等量的生理鹽水,觀察期內予與中藥藥液等量的蒸餾水灌胃；模型組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備，觀察期內予與中藥藥液等量的蒸餾水灌胃；高劑量組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備12 h后按1.56 g/kg劑量給予灌胃治療，每日2次；中劑量組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備12 h后按0.78 g/kg劑量給予灌胃治療，每日2次；低劑量組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備12 h后按0.39 g/kg劑量給予灌胃治療，每日2次。動物飼養于人工控制條件下，小鼠同室、分籠飼養，每籠6只。室溫控制在20～23℃，相對濕度為50%～60%，每12 h光照/黑暗循環，小鼠可自由進食、進水，保持墊料清潔干燥，實驗期為7 d。

1.3 檢測指標與方法

實驗第4 d和7 d，每組選擇5只小鼠麻醉后，斷頭取腦，剝離腦組織，取右側大腦半球置入凍存管中并迅速投入-80℃冰箱備存，其中一半用于組織勻漿采用ELISA方法檢測腦組織中TLR-2、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子含量，另一半提取總RNA用于熒光定量PCR檢測大鼠腦組織TLR-2、TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6等基因的表達，實驗方法按試劑盒說明書操作進行。

1.4 統計學處理

2 結果與分析

2.1 復方中藥對小鼠腦組織中炎性因子含量的影響

小鼠腦組織中炎性因子的檢測結果見表1。在實驗第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中的TLR-2含量顯著高于空白組(P<0.05)；在實驗第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中的TLR-2含量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

表1 復方中藥對小鼠腦組織中炎性因子含量的影響

注：與空白組同時間點比較，*P<0.05；與模型組同時間點比較，△P<0.05

在實驗第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著高于空白組(P<0.05)；在實驗第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

2.2 復方中藥對小鼠腦組織TRIF/NF-κB信號通路基因表達的影響

復方中藥對小鼠腦組織TRIF/NF-κB信號通路基因表達的影響見表2。在實驗第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中的TLR-2基因表達量顯著高于空白組(P<0.05)；在實驗第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中的TLR-2基因表達量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

在實驗第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6基因表達量顯著高于空白組(P<0.05)；在實驗第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中TRIF和NF-κB基因表達量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

3 討論

森林腦炎病毒感染腦組織后所引起的神經損傷是由多種不同因素共同參與的，其病理過程極其復雜。近年來，對急性免疫所介導的炎癥反應對腦組織造成的繼發性損傷越來越受到臨床研究重視。有研究指出，腦在感染病毒后會引起組織的中性粒細胞的滲出、浸潤，進而釋放出不同類型的炎性細胞因子，同時也會引起腦組織中微血管循環的阻塞，從而造成病灶局部的腦缺血。有研究證明，患有腦炎的幼兒的腦脊液中，IL-6會出現過度高表達的現象，導致患者出現細胞毒性腦水腫，并伴隨神經細胞的損傷，而且這種IL-6高表達與神經功能缺損程度呈正相關。研究還發現，腦中的IL-6可以通過激活補體系統對腦細胞造成損害，而且補體系統被激活后，還會產生大量過敏毒素并進一步刺激TNF-α的分泌，從而激活并增加腦細胞中黏附分子的表達，并釋放相關的蛋白酶和氧化酶，導致腦組織的繼發性損害的加劇[3]。有研究表明， IL-1β、IL-6等炎性因子會先后釋放到動物的腦組織中，而這些炎性因子會對血腦屏障造成破壞，增強血腦屏障的通透性，從而介導了腦組織發生急性免疫的炎癥損傷，加重腦組織的損害，并進一步加重神經細胞的變性、壞死情況；而減弱IL-1β、IL-6等炎性細胞因子的活性，動物腦組織的損傷程度也隨之減輕[4]。研究表明，TNF-α等炎性因子通過增強腦組織內皮細胞中NO的毒性來對血腦屏障進行破壞，動物感染病毒性腦炎后，TNF-α可以通過激活信號通路引發神經細胞、內皮細胞甚至膠質細胞的凋亡，而且TNF-α的大量分泌引起的鈣超載和自由基的過量產生也可以誘導細胞的凋亡[5]。在本實驗中，經過中、高劑量治療后，感染森林腦炎病毒的小鼠腦組織中的炎性因子含量顯著降低，說明復方中藥可以有效降低感染小鼠腦組織的炎性反應，減輕腦組織損傷。

表2 復方中藥對小鼠腦組織TRIF/NF-κB信號通路基因表達的影響

注：與空白組同時間點比較，*P<0.05；與模型組同時間點比較，△P<0.05

目前，Toll樣受體(TLR)家族被認為是哺乳動物體內唯一能夠識別細胞外抗原信息，并將該信息向細胞內傳遞，從而引發炎癥級聯反應的關鍵跨膜蛋白家族。TLR家族的其他功能還包括調節免疫應答，促進免疫細胞表達相關免疫分子等。TLR-2是模式識別受體中的一種，主要分布在細胞表面，可以識別病毒病原相關分子模式(PAMPs)，在病毒入侵機體的早期即啟動固有免疫，其主要作用是促進細胞炎性因子的產生[6]。TLR-2特異性識別病毒PAMPs結構后，促使相關激活細胞信號轉導途徑，并進一步介導多種快速反應基因的活化，表達炎癥細胞因子、趨化因子和共刺激分子免疫細胞因子等，參與機體對抗原的防御反應，誘導炎癥反應。TLR-2的信號傳導包括兩條途徑：即髓樣分化因子(MyD88)的依賴和非依賴途徑，MyD88途徑被認為是TLR-2信號傳導的主要通路。TLR-2識別配體后，主要通過TRIF途徑活化NF-κB等誘導炎癥細胞釋放炎性因子并介導機體發生炎癥反應，對病毒產生天然免疫。因此，NF-κB是重要的炎癥調控因子，它通過誘導激酶激活IκB家族中的α、β激酶，使IκB磷酸化降解。NF-κB除了調控多種炎癥因子外，還是一種能夠將細胞核內外信息雙向傳遞的的多向性轉錄因子。該功能使NF-κB 被激活后能夠進入核內進一步調控TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等多種炎癥因子的靶基因轉錄。因此，正常細胞中只需要有少量的NF-κB表達，而如果細胞過量NF-κB表達會給機體組織造成損傷[7]。研究證實，NF-κB 可以誘導多種神經毒性物質表達以及神經細胞凋亡，尤其在病毒性腦炎的腦組織繼發性損害中起重要作用[8]。研究發現，TLR-2活化后能誘導細胞損傷, 活化的TLR-2可以通過內源性和外源性兩條途徑誘導細胞的凋亡，并破壞體內的血管屏障引起病毒擴散，從而加速疾病的惡化進程[9]。臨床研究表明，TLR-2是森林腦炎病毒感染并加重中樞神經系統損傷的危險因素之一，森林腦炎病毒可引起動物腦組織中NF-kB蛋白水平和mRNA水平顯著的升高，這一變化加重了腦炎的炎癥反應，會對預后產生不利影響[10]。由此可見，在感染森林腦炎病毒后，動物腦組織細胞中的TLR/TRIF信號通路是重要的炎性介導途徑，該信號通路通過激活下游炎癥信號使下游炎性因子過度表達，誘發級聯式炎癥反應，加重森林腦炎向不良方向轉變[10]。本實驗熒光定量 PCR結果顯示，雖然經過治療后，感染森林腦炎病毒小鼠TLR-2、TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6依然要顯著高于空白組，但是中、高劑量的藥物治療組顯著低于對照組，再結合中、高劑量組小鼠腦組織中的炎性因子也顯著低于模型組，說明復方中藥可以通過抑制TLR/TRIF信號通路蛋白的表達，進而抑制感染森林腦炎病毒小鼠的炎癥反應。

4 結論

綜上所述，通過本實驗研究發現，復方中藥可以通過降低TLR/TRIF信號通路上TLR-2的表達，進一步抑制該通路下游的TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6蛋白的表達，從而抑制森林腦炎病毒感染小鼠腦組織中TLR-2誘導的炎性級聯反應，降低森林腦炎病毒感染引起的腦組織急性免疫介導的炎癥損害，保護腦組織不會受到炎癥反應繼發性損傷，為臨床治療森林腦炎提供了新的、有效的治療手段。