不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用及炎癥因子比較研究

李衛(wèi)先，王文翰，劉園園，王議憶

(湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,是一種以關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞為主的自身免疫性疾病。獨(dú)活寄生湯由中藥獨(dú)活、桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥和干地黃15味中藥組成[1],近代主要用該方治療痹證日久而致正氣不足者。臨床主要用于治療慢性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),該方具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[6-7]。方中杜仲有生杜仲、鹽杜仲，牛膝有生牛膝、酒牛膝，川芎有生川芎、酒川芎，當(dāng)歸有生當(dāng)歸和酒當(dāng)歸，白芍有生白芍和酒白芍等炮制品。但原方并未闡明方中各藥所用的具體炮制品。故本研究采用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠動(dòng)物模型，從免疫器官、抗炎、調(diào)節(jié)炎癥因子等方面對(duì)不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯的藥效進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究，而探討?yīng)毣罴纳鷾R床上用于治療佐劑性關(guān)節(jié)炎時(shí)杜仲、牛膝、川芎、當(dāng)歸、白芍在獨(dú)活寄生湯配方中最佳的炮制品，為其臨床應(yīng)用提供可靠的藥效學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

實(shí)驗(yàn)所用藥材獨(dú)活、桑寄生、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、當(dāng)歸、干地黃、杜仲、人參、白芍、甘草等均由湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬一醫(yī)院提供，按《中國(guó)藥典》(2015一部)鑒定為合格藥材。弗氏完全佐劑( Freund scomplete adjuvant，F(xiàn)CA)為Sigma公司產(chǎn)品，試劑腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6) 酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)，購(gòu)自上海科興商貿(mào)有限公司。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠225只，雌雄各半，鼠齡6周，體質(zhì)量(200±20)g，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu),許可證編號(hào)：SCXK(湘)2015-0008。

1.3 儀器

中佳KLC-2046型低速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),恒溫恒濕箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),全自動(dòng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 樣品的分組及提取

2.1.1 樣品的分組

樣品中獨(dú)活寄生湯皆按《方劑學(xué)》教材規(guī)定的劑量稱取[1]，1組:組成成分為生品組方的獨(dú)活寄生湯的水煎液，具體組成為：獨(dú)活9 g，桑寄生6 g，杜仲6 g，牛膝6 g，細(xì)辛6 g，秦艽6 g，茯苓6 g，肉桂6 g，防風(fēng)6 g，川芎6 g，人參6 g，甘草6 g，當(dāng)歸6 g，白芍6 g，干地黃6 g；2組：杜仲鹽炙其它藥物均為生品組方的獨(dú)活寄生湯；3組：牛膝、川芎、當(dāng)歸、白芍均酒炙，其它藥物均為生品組方的獨(dú)活寄生湯；4組：杜仲鹽炙、牛膝、川芎、當(dāng)歸、白芍均酒炙，其它藥物均為生品組方的獨(dú)活寄生湯。以上各組各藥用量同1組。

2.1.2 樣品的提取

以上各組藥按量稱取各藥后常溫(25℃) 加蒸餾水2 000 mL浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min過濾藥液，藥渣加1 000 mL蒸餾水再煎煮25 min，合并兩次濾液，濃縮至獨(dú)活寄生湯約0.5 g/mL，1.0 g/mL，2.0 g/mL，放入4℃冰箱備用。

2.2 動(dòng)物造模

將225只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，阿司匹林組，獨(dú)活寄生湯1、2、3、4 組的高、中、低劑量組(每組15只)15組。除對(duì)照組外，其余各組大鼠左后足常規(guī)消毒后，于左后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 mL 制備佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，正常組注射相應(yīng)體積生理鹽水。第7 d加強(qiáng)一針，復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。以造模后12 d左右大鼠對(duì)側(cè)足跖明顯腫脹，行動(dòng)不便并且體質(zhì)量明顯下降為成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。

2.3 給藥劑量及方法

不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯1、2、3、4組的高、中、低劑量各給藥組于大鼠造模前3天和造模后12 d按生藥量折算[9]每日灌胃給予獨(dú)活寄生湯0.85，1.7，3.4 g/kg相應(yīng)藥, 陽性對(duì)照組灌胃給予0.2 g/kg的阿司匹林片，對(duì)照組和模型組小鼠給予等容量生理鹽水，連續(xù)給藥16 d，實(shí)驗(yàn)期間正常飼養(yǎng)，自由飲水。

2.4 抗炎實(shí)驗(yàn)

原發(fā)性及繼發(fā)性足腫脹度測(cè)定在大鼠踝關(guān)節(jié)處做標(biāo)記，用大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x分別測(cè)量于致炎前每只大鼠左、右后肢足容積(mL)，分別于致炎后12、24、36、48 及72 h測(cè)定大鼠致炎側(cè)足容積，測(cè)量3次，以致炎前、后致炎足容積差平均值作為原發(fā)性腫脹度。分別于致炎第12、16、20、24、28 d用同樣方法測(cè)定大鼠非致炎側(cè)足容積，求出腫脹度平均值作為繼發(fā)性足腫脹度，以觀察佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原發(fā)性和繼發(fā)性病變。

2.5 免疫實(shí)驗(yàn)

各組胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)、體質(zhì)量增長(zhǎng)率測(cè)定上述2.4實(shí)驗(yàn)中所有大鼠于致炎后28 d，禁食不禁水12 h，稱定質(zhì)量后用乙醚麻醉，取胸腺及脾臟并稱重，分別計(jì)算胸腺及脾臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體質(zhì)量(g)；分別記錄大鼠體質(zhì)量的變化情況，計(jì)算體質(zhì)量增長(zhǎng)率。體質(zhì)量增長(zhǎng)率=(給藥后體質(zhì)量-造模前體質(zhì)量)/造模前體質(zhì)量×100%。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2.6 抗炎機(jī)制實(shí)驗(yàn)

2.6.1 血清TNF-α及IL-6含量測(cè)定

上述2.5實(shí)驗(yàn)中所有大鼠于致炎后28d，麻醉后，迅速剖腹，腹主動(dòng)脈取血5 mL，靜置，4℃離心10 min，分離血清于-20℃保存待測(cè)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法按照試劑盒操作測(cè)定血清TNF-α及IL-6含量。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2.6.2 關(guān)節(jié)液PGE2含量測(cè)定

上述2.5實(shí)驗(yàn)中所有大鼠于致炎后28 d，麻醉后，于左側(cè)踝關(guān)節(jié)上0.5 cm處剪下炎性腫脹足，稱重、剪碎，生理鹽水5 mL浸泡2 h，取出足爪，2 500 r/min離心浸泡液10 min，取上清液0.3 mL，加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液1.0 mL，50℃水浴20 min異構(gòu)化，加甲醇2.5 mL，在278 nrn波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，用吸光度(A)表示PGE2含量。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

3 結(jié)果

3.1 不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯對(duì)大鼠原發(fā)性病變的影響

由表1可見，與正常組相比，模型組大鼠左足明顯腫脹(P<0.01),不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯從致炎后6 h開始發(fā)揮療效。各組灌胃給藥后，1組的中、高劑量組，2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組均可不同程度減輕大鼠原發(fā)性病變，左后足腫脹程度均明顯輕于模型組，與模型組比較有顯著的差異(P<0.05);第4組的高劑量組、阿司匹林組減輕大鼠原發(fā)性病變的作用與模型組比較有顯著的差異(P<0.01)且強(qiáng)于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯對(duì)大鼠繼發(fā)性病變的影響

由表2可見，與正常組相比，模型組大鼠在致炎后16 d右后足出現(xiàn)明顯腫脹，且持續(xù)到第28 d，各不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯口服給藥后，1組的中、高劑量組， 2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組均可不同程度減輕大鼠繼發(fā)性病變，右后足腫脹程度均明顯輕于模型組，與模型組比較有顯著的差異(P<0.05)；第4組的高劑量組、阿司匹林組減輕大鼠繼發(fā)性病變的作用與模型組比較有顯著的差異(P<0.01)且強(qiáng)于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同炮制品組方的獨(dú)活寄生物對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原發(fā)性足跖腫脹度的影響

注:與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05；與生品組比較,△△P<0.01，△P<0.05

表2 不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足跖腫脹度的影響

注:與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05；與生品組比較,△△P<0.01，△P<0.05

3.3 不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯對(duì)大鼠胸腺、脾臟指數(shù)和體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響

由表3可見，模型組大鼠的胸腺指數(shù)明顯低于正常組(P<0.05); 與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.01);各組口服給藥后，1組的中、高劑量組，2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組與模型組比較均可明顯增加大鼠胸腺系數(shù)(P<0.05)和體質(zhì)量(P<0.05)。4組高劑量組可顯著增加大鼠胸腺系數(shù)和體質(zhì)量，與模型組比較，有顯著差異(P<0.01)且作用強(qiáng)于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。脾臟系數(shù)數(shù)值上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而阿司匹林對(duì)大鼠胸腺、脾臟指數(shù)和體質(zhì)量無明顯影響。

表3 對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率和臟器系數(shù)及大鼠血清IL-6、TNF-α及關(guān)節(jié)液PGE2水平的影響

注:與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05；與生品組比較,△△P<0.01，△P<0.05

3.4 抗炎機(jī)制實(shí)驗(yàn)

不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯對(duì)大鼠血清 TNF-α、IL-6及關(guān)節(jié)液PGE2水平的影響

由表3可見；模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 及關(guān)節(jié)液PGE2水平均顯著高于正常組(P<0.01); 各組口服給藥后，1組的中、高劑量組，2組中、高劑量組，3組中、高劑量組，4組中劑量組與模型組相比較，均能不同程度降低 TNF-α、IL-6、PGE 2水平(P<0.05)。其中，第4組高劑量組與模型組比較能顯著降低 TNF-α、IL-6、PGE 2且作用強(qiáng)于其他各組和生品組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 討論

佐劑性關(guān)節(jié)炎分原發(fā)性反應(yīng)期和繼發(fā)性反應(yīng)期，原發(fā)性病變表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應(yīng)，繼發(fā)性病變一般出現(xiàn)于致炎后10d左右，表現(xiàn)為雙側(cè)足腫脹進(jìn)行性加重，活動(dòng)受限，本病乃風(fēng)寒濕邪痹著日久，導(dǎo)致肝腎不足，氣血兩虛而成的虛實(shí)夾雜之癥[10]。獨(dú)活寄生湯在臨床上應(yīng)用廣泛，為治療痹證日久方[11]。本研究選擇獨(dú)活寄生湯全方生品1、部分炮制2、3、4等4個(gè)組，選擇全方生品，就是為了對(duì)比原方經(jīng)部分藥物炮制后藥效作用是否增強(qiáng)，為探討炮制的必要性提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)性、繼發(fā)性模型組大鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、足腫脹非常明顯，各不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯治療組隨著治療的進(jìn)行，各組大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎癥狀均有明顯改善作用，至服藥完畢時(shí)一般體征恢復(fù)正常，由不同炮制品組方的獨(dú)活寄生湯各組均優(yōu)于生品組。且由鹽炙杜仲、酒炙牛膝、酒川芎、酒當(dāng)歸、酒白芍組方的獨(dú)活寄生湯高、中劑量組能顯著抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原、繼發(fā)性足跖腫脹程度，對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有明顯改善作用。胸腺和脾臟是機(jī)體質(zhì)量要的免疫器官，因此動(dòng)物免疫功能及炎癥情況在胸腺、脾臟指數(shù)方面有一定程度的表現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，由鹽炙杜仲、酒川芎、酒炙牛膝、酒當(dāng)歸、酒白芍組方的獨(dú)活寄生湯的高、中劑量組能夠顯著促進(jìn)大鼠免疫器官胸腺的發(fā)育，這對(duì)于增強(qiáng)大鼠機(jī)體免疫機(jī)能有積極意義。TNF-α、IL-6是佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型滑膜組織的促炎因子，會(huì)刺激滑膜組織，引起PGE2及NO大量合成和釋放，從而引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織異常增生導(dǎo)致組織損傷、關(guān)節(jié)腫脹的一種狀態(tài)[12]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由酒炙牛膝和鹽炙杜仲、酒川芎、酒當(dāng)歸、酒白芍組方的獨(dú)活寄生湯的高、中劑量組可明顯降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α、IL-6的水平并能能顯著抑制PGE2含量，且上述抗炎、提高免疫、降低炎性細(xì)胞因子的作用均優(yōu)于不同炮制品組方的其他組。由此推測(cè)降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)的水平及關(guān)節(jié)液中PGE2含量可能是獨(dú)活寄生湯治療佐劑性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一，其詳細(xì)機(jī)制有待于深入研究。綜合文獻(xiàn)報(bào)道及我們的研究，證實(shí)獨(dú)活寄生湯用于治療佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎癥時(shí)，組方中牛膝和川芎、當(dāng)歸、白芍等藥宜用酒炙品，杜仲宜用鹽炙品，這與文獻(xiàn)中記載[13-15]的杜仲鹽炙能引藥入腎，增強(qiáng)補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，增強(qiáng)免疫、擴(kuò)張血管，牛膝、川芎、當(dāng)歸、白芍酒炙能增強(qiáng)活血通絡(luò)、抗炎、止痛的作用是一致的。