鎖陽藥材HPLC-ELSD特征指紋圖譜的研究

李倩，衛陽飛，黃瑞萍，安瓊,*

(1.河西學院醫學院中西醫結合研究所,甘肅 張掖 734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用省級重點實驗,甘肅 張掖 734000)

鎖陽,俗稱“不老藥”,又名繡鐵棒、地毛球、沙漠人參等,為鎖陽科植物鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.的干燥肉質莖。鎖陽有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效,用于腎陽不足,精血虧虛,腰膝酸軟,陽痿滑精,腸燥便秘等[1]。鎖陽廣泛分布于甘肅、新疆、內蒙、寧夏、青海等地,其中質量最好的是甘肅河西地區瓜州的鎖陽,有“瓜州鎖陽甲天下”的美譽,特別是鎖陽城“三九鎖陽”，更是鎖陽中的極品,被當地人視為珍寶,人稱“三九鎖陽賽人參”[2-4]。

據文獻的報道,對鎖陽藥材的研究，主要探討了化學成分[5]、提取工藝[6-7]、藥理活性[8-9],用特征指紋圖譜系統控制鎖陽藥材質量研究較少，除了劉曄瑋等，建立鎖陽藥材不同產區高效液相色譜二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)指紋圖譜，針對甘肅河西道地藥材鎖陽特征指紋圖譜的研究尚未見到報道。

鎖陽藥材中含有鞣酸、黃酮、三萜、酸性多糖、甾體、木脂素和生物堿等多種成分。常艷旭等研究者認為兒茶素可作為鎖陽活性成分黃酮類的代表，熊果酸可作為活性成分三萜類的代表[10-11]。對其指標性成分的含量測定，紫外檢測器的方法較多[12]。但熊果酸結構中無共軛結構和強的生色團，用紫外檢測器測定末端吸收干擾較大[13]。蒸發光散射檢測器(ELSD)是一種通用型檢測器，它可以對末端吸收弱、沒有生色團的物質均產生響應。對于中藥材，根據指標成分的特點構建與之相適應的分析方法，可有效表征鎖陽藥材化學成分,對其評價其質量和真偽具有重要意義。

本文根據熊果酸的結構特點，探索了用HPLC-ELSD法測定鎖陽藥材三萜類代表的指標性成分熊果酸，分析了不同產地不同批次甘肅河西道地鎖陽藥材，建立了甘肅河西道地鎖陽藥材HPLC-ELSD特征指紋圖譜并對不同產區的藥材質量進行了評價。通過聚類分析，對不同批次鎖陽藥材的起源進行了識別，為甘肅河西道地鎖陽藥材質量控制提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 藥材及試劑

1.1.1 藥材

鎖陽藥材，購自當地的藥店。獲得的藥材由河西學院醫學院宋玉霞老師鑒定為為鎖陽科植物鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.的干燥肉質莖(樣品信息見表1)。

表1 樣品信息表

1.1.2 試劑

熊果酸對照品購自北京世紀奧科生物科技有限公司(批號分別為：1511127 純度≥98.0%),乙腈(色譜純，山東禹王試劑廠)，甲醇(色譜純，山東禹王試劑廠)，乙醇(分析純，安徽安特生物化學有限公司出品)，冰醋酸(分析純，上海玻爾化學試劑有限公司)，三氟乙酸(南京國晨化工)，水為重蒸水。

1.2 儀器和色譜條件

1.2.1 儀器

高效液相色譜儀，蒸發光散射檢測器，自動進樣閥。KH-3000DB數控型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)。十萬分之一天平(上海奧豪斯Discovery專業性分析天平)，用于標準品、樣品的稱量。小型中藥粉碎機(久品旗艦店)，粉碎鎖陽藥材。

1.2.2 色譜條件

Inertsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)為固定相,流動相組成：A為乙腈，B為0.1%的三氟乙酸水溶液；線性梯度洗脫程序見表2，每次進樣之前用初始梯度濃度平衡約10 min。柱溫室溫，流速0.8 mL·min-1，漂移管75℃，氣體流速2.0 L·min-1。

表2 梯度洗脫程序(%)

1.3 溶液制備

對照品制備：稱取熊果酸的對照品適量用流動相溶解，置成約2.0 mg·mL-1的溶液,用0.22 μm的微孔濾膜過濾，備用。

供試品制備：取10批鎖陽藥材的樣品各自粉碎，過80目篩，稱取約1.0 g，精密稱定。置于100 mL錐形瓶，量取70%乙醇10 mL，在溫度60℃，超聲頻率100 Hz，超聲30 min，濾過，濾液濃縮后加入約10 mL流動相, 用0.22 μm的微孔濾膜過濾，按1.2.2項下色譜條件分析。

1.4 實驗數據分析

采用國家藥典委員會開發的中藥色譜特征指紋圖譜相似度評價系統研究版(2004A)，生成對照圖譜，計算相似度；用SPSS(22.0)軟件做聚類分析；用Origin6.0軟件做圖。

2 結果和討論

2.1 優化提取條件

鎖陽樣品，用超聲波法提取。首先考察不同類型的提取溶劑(水、甲醇、乙醇和乙醚等)對其活性成分提取的影響。然后系統考察不同溫度，不同溶劑，不同溶劑比例，提取次數對起提取的影響，實驗采用L9(34)正交試驗設計，用極差分析作為結果的評價，選出最佳鎖陽藥材活性成分的提取方法。實驗結果表明溫度在60℃，用70%乙醇做溶劑，溶劑量10 mL，提取一次，提取的鎖陽樣品色譜峰的出峰個數較多。

2.2 優化HPLC-ELSD的色譜條件

2.2.1 流動相組成

先用等度洗脫程序，甲醇-水，甲醇-水(0.05%三氟乙酸)，甲醇-水(0.10%三氟乙酸)，甲醇-水(0.12%三氟乙酸)，乙腈-水(0.05%三氟乙酸)，乙腈-水(0.10%三氟乙酸)，乙腈-水(0.12%三氟乙酸)分別作為流動相，以樣品的出峰數目、分離度、峰形作為考察指標選擇流動相的組成。結果顯示甲醇-水做為流動相鎖陽藥材的色譜峰的出峰個數較多、有較好的分離度，當在水溶液中加入0.10%三氟乙酸，色譜峰比較對稱。于是甲醇-水(0.10%三氟乙酸)作為樣品分析的流動相。然后選用梯度洗脫程序，優化梯度洗脫程序，當在1.2.2項下的梯度程序時，鎖陽藥材的成分分離度較好，出峰較多。

2.2.2 流速

對于流速，雖然隨著流速的增加(0.6，0.7，0.8,0.9，1.0 mL·min-1)分析時間縮短。但是，流速大于1.0 mL·min-1時保留時間相近的色譜峰會被掩蓋；流速低于0.7 mL·min-1，分析時間延長且色譜峰重疊的較多，出峰個數減少。因此實驗選用0.8 mL·min-1流速作為最佳流速。

2.2.3 漂移管的溫度

對于蒸發光散射檢測器，漂移管的溫度是一項重要的影響參數。當漂移管的溫度低時，溶劑發揮不完全；漂移管的溫度高時，因分析樣品中含有揮發性的成分，檢測器的響應會下降[14]。在實驗的過程中，我們考察了漂移管的溫度在(65、70、75、80、85℃)對樣品出峰數的影響，當溫度低于75℃時，溶劑發揮不完全，溫度高于75℃時，因鎖陽藥材樣品中含有的揮發性成分，導致檢測器的響應下降，結果二者均使出現在色譜圖上的色譜峰個數減少，于是我們選擇了75℃作為漂移管的最佳溫度。

2.2.4 氣體流速

霧化氣體的流速對樣品的出峰也有重要的影響，流速度太低時，會形成大量微滴，導致色譜峰出現尖峰信號或噪音信號；霧化氣流速度太高時，微滴會大量下降，導致信號響應降低流速，我們考察了(1.8、2.0、 2.2 L·min-1)下的實驗結果，當霧化氣流速度低于2.0 L·min-1時，色譜圖上出現尖峰的信號；霧化氣流速度高于2.0 L·min-1時，出現在色譜圖上的色譜峰個數減少，于是我們選擇了2.0 mL·min-1作為氣體的流速。

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關系

取1.3項下制備的對照品溶液適量，用流動相分別稀釋成約0.05,0.1,0.2,0.4,0.8 mg·mL-1的溶液，按1.2.2項下優化的色譜條件，測定熊果酸峰面積，以對照品的濃度作為為橫坐標(Y)，峰面積作為縱坐標(X)，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程為:Y=5.198 43X+3.978 83，r=0.999 8，實驗結果表明在優化的色譜條件下熊果酸在濃度0.05～0.8 mg·mL-1的范圍內線性良好。

2.3.2 精密度試驗

取標準曲線項下的溶液，在優化的色譜條件下，連續進樣6次，記錄熊果酸色譜峰的峰面積，計算RSD,RSD為0.95%，結果顯示該方法有好的精密度。

2.3.3 穩定性試驗

取供試品溶液(批號1)，配制后的0、2、4、6、8、10、12 h分別在優化的色譜條件下進樣分析，記錄熊果酸色譜峰的峰面積，計算RSD,RSD為1.08%，結果顯示鎖陽藥材樣品在12 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗

取同一批鎖陽藥材(批號1)5份，每份樣品取1 g，精密稱定。各自按供試品溶液制備方法處理，按1.2.2項下色譜條件，每個樣品連續進樣3次，記錄熊果酸峰色譜峰的峰面積，計算RSD,RSD為1.01%，結果表明其重復性良好。

2.4 建立不同產地樣品HPLC-ELSD特征指紋圖譜

2.4.1 特征指紋圖譜的建立

特征指紋圖譜是一種包含中藥材中共有成分的色譜模式[15]，它反映了該藥材中起藥理活性的主要化學組分，體現了不同批次不同產區樣品之間的相似性。在實驗的過程中將樣品圖譜與特征指紋圖譜做對照，用相關系數的中位數作為評價的指標，相關系數的中位數的值越大，說明二者越相似，樣品可以鑒別為真品且該樣品的質量較好。構建特征指紋圖譜包括確定共有峰、計算相對保留時間(RRA)和相對峰面積(RPA)。

將制備好的鎖陽藥材的供試品溶液，在優化的色譜條件分別進樣分析，獲得10批樣品的色譜圖。然后將10批樣品色譜圖的實驗數據導入中藥色譜特征指紋圖譜相似度評價系統，生成對照圖譜，根據色譜峰的保留時間和峰面積，確定了12個共有峰做為鎖陽藥材的共有峰。將熊果酸的對照品(圖1)與樣品比較，11號為熊果酸的色譜峰重現性良好，作為參照峰(S)。計算10批樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積，作為鎖陽藥材特征指紋圖譜的定量表達，結果見表3和表4。RSD低于1.5%，結果顯示該法有較好的穩定性和重復性。建立的甘肅河西道地鎖陽的特征指紋圖譜可以用于其藥材真偽的鑒別和質量的評價。

2.4.2 相似度計算

將2.4.1生成的參照圖譜圖2，與10批藥材的樣品色譜圖比較，計算相關系數的中位數，評價不同批次藥材之間的相似似度。甘肅民樂(S1-S3)、甘肅高臺(S4-S5)、甘肅瓜州(S6-S8)及甘肅甘州(S9-S10)的樣品相似度相關系數中位數分別為0.821 9,0.925 8,0.846 5,0.832 3,0.932 2,0.902 4,0.913 3,0.928 0，0.965 1,0.863 2。參照李丹毅的研究，相似度相關系數的中位數在0.9以上評價為優質藥材，0.8～0.9評價為質量一般的藥材，低于0.8評價為偽劣藥材[16]。結果顯示：批號S2,S5,S6,S7,S8,S9為優質藥材，批號S1，S3，S4，S10質量一般。10批樣品疊加的圖譜見圖3。

2.4.3 聚類分析

聚類分析是一種判別模式，中藥材通過該模式可以判別藥材起源的相近性[17]。將10批不同產地的鎖陽藥材的共有峰的相對峰面積導入統計學軟件，做聚類判別。結果如圖4，S6、S7、S8樣品在聚類圖上離的比較遠；S1、S2、S3樣品在聚類圖近于S6-S8的藥材，S4、S5、S9、S10離的比較近。S6-S8是瓜州的藥材，在地理位置距離民樂、高臺、甘州比較遠，其它的藥材來源屬于同一市區的，在距離上比較近。不同批次之間也有一定的差異。實驗結果可以區別不同產地不同批次的鎖陽藥材。

表3 HPLC-ELSD色譜條件各批藥材共有峰的相對保留時間

表4 HPLC-ELSD色譜條件各批藥材共有峰的相對峰面積

圖1 HPLC-ELSD色譜條件下對照品色譜圖

圖2 HPLC-ELSD色譜條件下10批樣品的共有模式圖

圖3 HPLC-ELSD色譜條件下10批樣品色譜圖

圖4 聚類分析樹狀圖

3 結論

本研究根據鎖陽藥材指標性成分熊果酸無共軛結構和強的生色團，構建了鎖陽藥材的HPLC-ELSD特征指紋圖譜。對建立的方法進行方法學的考察，結果表明，建立的方法具有好的精密度、重復性和穩定性。結合中藥相似度系統評價相似度和聚類分析模式判別的結果，建立的HPLC-ELSD特征指紋圖譜方法，可準確的用于不同產區不同批次鎖陽藥材質量的鑒別和的產地的區分。