白腐乳中一株腐生葡萄球菌ZH910的分離鑒定

劉 力，周其洋

（佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528000）

腐乳是利用大豆制備的一種經(jīng)微生物發(fā)酵的干酪型產(chǎn)品[1]。腐乳按其色澤風(fēng)味可分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳和各種花色腐乳[2]，其中毛霉型白腐乳滋味鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富[3]，可佐餐，亦可調(diào)味[4]。近年來(lái)，科研人員一直不懈地改進(jìn)腐乳生產(chǎn)工藝，并對(duì)腐乳發(fā)酵體系中的微生物進(jìn)行了大量研究。凃婧等[5]研究指出，腐乳發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要多種微生物和酶的協(xié)同參與。蔣芳芳等[6]研究指出，腐乳特殊的色、香、味主要是毛霉（Mucor）和其他微生物共同發(fā)酵作用的結(jié)果。腐乳作為一種典型“生物活性”發(fā)酵食品[7]，體系中微生物的多樣性對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)形成起著決定性的作用[8]。魯緋[9]通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加乳酸菌，促進(jìn)了腐乳的成熟，改進(jìn)了產(chǎn)品風(fēng)味。楊佐毅等[10]研究了腐乳發(fā)酵體系中的細(xì)菌短桿菌屬（Brevibacterium）和酵母菌（Saccharomycetes），發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌株均具有較高的內(nèi)肽酶活力，酵母菌則具有較高的氨肽酶和羧肽酶活力。由此可知，傳統(tǒng)白腐乳發(fā)酵體系中含有大量的有益微生物，其對(duì)白腐乳風(fēng)味的形成具有重要的貢獻(xiàn)。

然而，現(xiàn)代白腐乳生產(chǎn)廠家多采用人工接種純種毛霉，產(chǎn)品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，但由于采用純毛霉發(fā)酵導(dǎo)致腐乳發(fā)酵體系中菌群相對(duì)單一[11]，且酶活力不高，進(jìn)而造成白腐乳產(chǎn)品風(fēng)味普遍不足，滿足不了現(xiàn)代人們的飲食需求。為了解決目前毛霉型白腐乳純種發(fā)酵模式下導(dǎo)致其他有益微生物的缺失從而引起產(chǎn)品風(fēng)味存在明顯不足的問(wèn)題，本試驗(yàn)嘗試?yán)眠x擇性培養(yǎng)基從市售風(fēng)味良好的白腐乳中分離風(fēng)味細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定；研究其生產(chǎn)特性、耐受性及應(yīng)用，以期建立一種提升白腐乳風(fēng)味的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 白腐乳樣品

5種品牌白腐乳商品信息如下：品牌A麻油白腐乳（基本組成為水、黃豆、食用鹽、白酒、芝麻油）；品牌B白腐乳（基本組成為水、黃豆、食用鹽、食用酒精、芝麻油）；品牌C麻油白腐乳（基本組成為水、黃豆、食用鹽、食用酒精、植物油）；品牌D麻油白腐乳（基本組成為水、非轉(zhuǎn)基因大豆、白酒、食用鹽、芝麻油）；品牌E白腐乳（基本組成為水、黃豆、食用酒精、食用鹽）。

1.1.2 培養(yǎng)基

風(fēng)味菌富集培養(yǎng)基：白腐乳汁（按照1.1.1節(jié)白腐乳，傾倒、過(guò)濾后熟45 d的白腐乳樣品汁液即可）200 mL，煮沸10 min去除汁中酒精，冷卻至常溫后，調(diào)整白腐乳汁中NaCl含量至（70±0.5）g/L，pH調(diào)節(jié)至6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min，以篩選出能夠適應(yīng)白腐乳發(fā)酵體系的風(fēng)味菌。

風(fēng)味菌分離培養(yǎng)基：在風(fēng)味菌富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂粉，121 ℃滅菌15 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，氯化鈉10 g/L，加水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

硝酸銀（分析純）：天津市銀恒化工有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；瓊脂、蛋白胨、酵母抽提物（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BS323S電子天平：德國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BX53F奧林巴斯顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；2K15冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)西格瑪公司；pH計(jì)PB-10：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。759S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白腐乳加工工藝流程及操作要點(diǎn)

豆腐坯→接種→培養(yǎng)→毛坯→搓毛→腌坯→裝瓶→封口→后熟→白腐乳

操作要點(diǎn)：市售黃豆室溫條件下經(jīng)水浸泡、磨漿，過(guò)篩得豆?jié){；豆?jié){經(jīng)加熱后，用酸水作為點(diǎn)漿劑，經(jīng)蹲腦后，壓榨瀝水成豆腐，最終含水量控制在75%左右，切成適當(dāng)?shù)男K制成豆腐坯。豆腐坯接種菌株為毛霉ZG701，保藏編號(hào)：GDMCC NO.60183；培養(yǎng)條件為25 ℃，霉菌培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)36 h形成毛坯。毛坯經(jīng)搓毛后，使用25%的無(wú)菌鹽水常溫腌制12 h后裝瓶，加入“白湯”（食鹽10%，食用酒精10%）封口，進(jìn)入后熟階段（60 d），即得白腐乳。

1.3.2 白腐乳的感官評(píng)價(jià)

召集8位經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)鑒評(píng)人員對(duì)市售白腐乳進(jìn)行感官評(píng)分[12]。感官評(píng)價(jià)滿分10分，白腐乳感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

續(xù)表

1.3.3 目的菌株的富集和分離

經(jīng)過(guò)感官鑒評(píng)后，挑選感官較佳（感官評(píng)分＞9分）的毛霉型發(fā)酵白腐乳成品，在無(wú)菌條件下將其湯液按照2%（V/V）的接種量接種至風(fēng)味菌富集培養(yǎng)基中；置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)72 h獲得風(fēng)味菌富集菌液。

在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水將風(fēng)味菌富集菌液濃度稀釋至10-5、10-6、10-7，涂布于風(fēng)味菌分離培養(yǎng)基上，于25 ℃倒置培養(yǎng)72 h后。挑選單菌落，進(jìn)行平板劃線分離，如此重復(fù)4～5次，直至獲得純的單菌落，分離獲得1株生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌，編號(hào)ZH910。于4 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.3.4 菌株ZH910的菌落、菌體形態(tài)的鑒定

將分離獲得的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌株ZH910劃線接種于風(fēng)味菌分離培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)、色澤、質(zhì)地。挑取待測(cè)菌菌苔進(jìn)行革蘭氏染色，使用10×100油鏡，觀察菌體形態(tài)。

1.3.5 菌株ZH910的分子鑒定及遺傳分析

將純化好的菌株ZH910送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S 核糖體脫氧核糖核酸（ribosomal deoxyribonucleic acid，16S rDNA）測(cè)序。將測(cè)序獲得的16Sr DNA序列置于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中，使用Blast程序進(jìn)行對(duì)比，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與菌株ZH910相似性較高的菌株序列，利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建微生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.6 菌株ZH910生長(zhǎng)特性及耐受性

種子液的制備：將菌株ZH910接種（約106CFU/mL）至LB培養(yǎng)基（100 mL裝液量/300 mL）中，于25 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，獲得菌株ZH910種子液，含菌量約為108CFU/mL。

菌株ZH910生長(zhǎng)特性：按1%的接種量（約106CFU/mL）將菌株ZH910種子液接種至裝液量為100 mL/300 mL的LB培養(yǎng)基中，分別在pH值自然（6.5）、10～50 ℃的溫度范圍內(nèi)（以5 ℃的溫度梯度遞增）恒溫靜置培養(yǎng)、初始pH在3～9范圍內(nèi)靜置培養(yǎng)48 h后，測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值），評(píng)估菌株ZH910生長(zhǎng)特性。

菌株ZH910耐受性：調(diào)整NaCl（2～20g/100g，以2 g/100 g NaCl的濃度梯度遞增）和乙醇的含量（2%vol～8%vol，以2%vol乙醇的濃度梯度遞增），按1%的接種量（約106CFU/mL）接種菌株ZH910種子液于LB培養(yǎng)基（100 mL裝液量/300 mL三角瓶）中，于最適宜初始pH和溫度條件下（具體參數(shù)由1.3.5菌株ZH910生長(zhǎng)特性決定），恒溫靜置培養(yǎng)48 h，測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值），評(píng)估菌株ZH910對(duì)NaCl和乙醇的耐受性。

1.3.7 菌株ZH910在白腐乳生產(chǎn)中的應(yīng)用

（1）菌株ZH910的擴(kuò)大培養(yǎng)

采用裝液量100 mL/300 mL，將獲得的菌株ZH910接種（約106CFU/mL）至風(fēng)味菌富集培養(yǎng)基中擴(kuò)培，25 ℃條件下，恒溫靜置培養(yǎng)48 h，在4 ℃、8 000 r/min 條件下離心10 min，取沉淀，獲取菌株ZH910的菌體。

（2）菌株ZH910發(fā)酵制作白腐乳

參見(jiàn)1.3.1節(jié)白腐乳的生產(chǎn)工藝流程，將獲取的菌株ZH910菌體使用“白湯”復(fù)溶制備成“含菌白湯”（含菌量約108CFU/mL）。將“含菌白湯”按照1%（V/V）的比例與“白湯”混合，在裝瓶時(shí)加入白腐乳發(fā)酵體系中，進(jìn)入后熟階段。

（3）菌株ZH910發(fā)酵效果評(píng)價(jià)

以不加入“含菌白湯”的白腐乳作為對(duì)照，發(fā)酵過(guò)程中取腐乳塊對(duì)樣品感官、理化指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以評(píng)估風(fēng)味菌株ZH910在白腐乳發(fā)酵過(guò)程中的應(yīng)用效果。

1.3.8 理化指標(biāo)檢測(cè)

氨基酸態(tài)氮含量、NaCl含量的測(cè)定均按照中華人民共和國(guó)商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10170—2007《腐乳》中的方法進(jìn)行；總酸含量的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售白腐乳理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)結(jié)果

對(duì)市售五種品牌白腐乳乳塊的理化及感官指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，市售白腐乳品牌的理化指標(biāo)一定程度上存在差異，pH值為5.7～6.4；氨基酸態(tài)氮含量為0.45～1.06 g/100 g，其含量能夠直接反映白腐乳乳塊的細(xì)膩、潤(rùn)滑程度。白腐乳乳塊氨基酸態(tài)氮含量越高，口感越細(xì)膩[13]。食鹽含量為7.0～11.0 g/100 g，在白腐乳發(fā)酵體系中的食鹽可以起到防腐和調(diào)味作用[14]。測(cè)定結(jié)果顯示，5個(gè)品牌白腐乳樣品均滿足SB/T 10170—2007《腐乳》中對(duì)于白腐乳的各理化指標(biāo)含量的要求（氨基酸態(tài)氮含量≥0.35g/100g，食鹽含量≥6.5 g/100 g）。

表2 白腐乳理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Results of physicochemical indexes and sensory evaluation of white sufu

由表2可知，在香氣和滋味評(píng)分上，品牌B樣品具有毛霉型白腐乳特有香氣，腐香濃郁、協(xié)調(diào)，無(wú)不良風(fēng)味，口感細(xì)膩，綜合最佳，因此樣品B樣品感官評(píng)分最高，為9.1分。而品牌E樣品香氣不準(zhǔn)確，口感略粗糙，感官評(píng)分最低為7.7分。品牌A樣品香氣不準(zhǔn)確，略有異味，口感不協(xié)調(diào)，感官評(píng)分8.0分；品牌C樣品香氣濃郁度稍弱，口感鮮味不足，略咸，感官評(píng)分8.4分；品牌D樣品口感過(guò)咸，香氣偏弱，不明顯，感官評(píng)分8.3分。綜上，選擇品牌B樣品作為風(fēng)味菌的篩選來(lái)源。

2.2 菌株ZH910的菌落、菌體形態(tài)的觀察

將品牌B樣品湯液在無(wú)菌條件下接種至無(wú)菌富集培養(yǎng)基中，25 ℃條件下，靜置培養(yǎng)72 h后。使用分離培養(yǎng)基對(duì)風(fēng)味菌富集菌液進(jìn)行劃線分離、純化，最終獲得1株具有明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的菌株ZH910。對(duì)菌株ZH910進(jìn)行菌落、菌體形態(tài)觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1A可知，菌株ZH910的菌落突起，呈圓形，直徑1～3 mm，灰白色，不透明，濕潤(rùn)光滑；由圖1B可知，菌株ZH910 革蘭氏染色結(jié)果呈陽(yáng)性（G+），球菌，呈葡萄狀排列。

圖1 菌株ZH910的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞特征（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell characteristics (B) of strain ZH910

2.3 菌株ZH910的分子生物學(xué)鑒定

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株ZH910系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZH910 based on 16S rDNA sequences

將菌株ZH910的16SrDNA基因序列導(dǎo)入NCBI，通過(guò)Blast程序獲得的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與待測(cè)菌株相似度高的菌株均為葡萄球菌屬。通過(guò)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析（見(jiàn)圖2）得出菌株ZH910與Staphylococcus saprophyticusstrain FDAARGOS 355親緣關(guān)系最近，相似度為99.65%。結(jié)合菌株ZH910形態(tài)學(xué)分析結(jié)果，因此，菌株ZH910被鑒定為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。葡萄球菌在中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中具有廣泛的存在，并發(fā)揮著重要作用[15-18]。

2.4 菌株ZH910的生長(zhǎng)特性

研究不同溫度及初始pH條件下，菌株ZH910在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株ZH910在不同溫度（A）及初始pH（B）條件下的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth situation of strain ZH910 at different temperature (A)and different initial pH (B)

由圖3A可知，菌株ZH910在15～40 ℃較寬的溫度范圍內(nèi)均可以較好的生長(zhǎng)，在25 ℃時(shí)，其生長(zhǎng)情況最佳；當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。因此，選用25 ℃作為菌株ZH910的后續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)溫度。

由圖3B可知，在pH4～6范圍內(nèi)，菌株ZH910的OD600nm值隨著pH值的升高而增加，pH6時(shí)，OD600nm值達(dá)到最高；當(dāng)pH6～10時(shí)，菌株的生長(zhǎng)繁殖隨著pH的升高而受到抑制。因此，選擇pH6作為后續(xù)菌株ZH910培養(yǎng)生長(zhǎng)初始pH。

2.5 菌株ZH910對(duì)NaCl和乙醇的耐受性

腐乳發(fā)酵體系中的食鹽不僅起到調(diào)味作用，還可以抑制不耐鹽微生物的生長(zhǎng)，起到防腐作用；乙醇是腐乳發(fā)酵體系中“白湯”的重要組成成分，一方面參與腐乳特有風(fēng)味的形成，另一方面和食鹽協(xié)同作用起到防腐作用[19-21]。

確定LB培養(yǎng)基的初始pH值6，培養(yǎng)溫度25 ℃，改變培養(yǎng)基體系中的NaCl含量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，評(píng)估菌株ZH910的耐受食鹽及乙醇能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 菌株ZH910在不同NaCl（A）和乙醇（B）含量下的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth situation of strain ZH910 under different NaCl (A)and alcohol (B) contents

由圖4A可知，菌株ZH910的生長(zhǎng)受NaCl含量影響較大。當(dāng)NaCl含量為4%時(shí)，菌體生長(zhǎng)繁殖達(dá)到最適食鹽含量，隨著體系食鹽含量的繼續(xù)增加，菌株ZH910生長(zhǎng)繁殖受到顯著的抑制。然而，當(dāng)NaCl含量達(dá)到18%時(shí)菌株ZH910仍能生長(zhǎng)繁殖，表現(xiàn)出菌株ZH910具有非常強(qiáng)的耐食鹽能力。朱雯娟[22]從發(fā)酵梅香魚中分離獲得一株的腐生葡萄球菌，其可耐受20%NaCl。鑒于市售5種品牌腐乳成品體系的食鹽含量為7.0～11.0 g/100 g，可知菌株ZH910可以耐受白腐乳發(fā)酵體系的食鹽環(huán)境。

由圖4B可知，乙醇對(duì)菌株ZH910的生長(zhǎng)繁殖具有明顯的抑制作用，但其對(duì)乙醇的耐受能力達(dá)到6%vol，意味著菌株ZH910能夠在白腐乳發(fā)酵體系中發(fā)揮作用。在乙醇含量達(dá)到6%vol時(shí)，菌株ZH910仍具有微弱的生長(zhǎng)繁殖能力。

2.6 目的菌株在白腐乳中的應(yīng)用效果

將風(fēng)味菌富集培養(yǎng)基擴(kuò)培、離心獲得的菌株ZH910菌體加入白腐乳的后熟體系中，靜置發(fā)酵60 d。對(duì)其后熟周期內(nèi)的腐乳進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)及感官鑒評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 添加菌株ZH910的毛霉型白腐乳理化及感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Results of physicochemical indexes and sensory evaluation of Mucor-white sufu with strain ZH910

由表3可知，隨著后熟周期的延長(zhǎng)，腐乳的氨基酸態(tài)氮含量、香氣及口感得分逐漸增加；與對(duì)照腐乳相比，菌株ZH910加入到毛霉型白腐乳發(fā)酵體系中，體系的產(chǎn)香速率明顯提升：在后酵60 d后，其乳塊腐香濃郁、協(xié)調(diào)，評(píng)分4.5分；另外，其口感鮮、咸協(xié)調(diào)，細(xì)膩、潤(rùn)滑，評(píng)分4.8分。均顯著優(yōu)于對(duì)照3.6分和3.2分的香氣偏弱，不明顯；鮮味不足，偏咸，略粗的口感。對(duì)乳塊氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)后熟階段試驗(yàn)樣氨基酸態(tài)氮指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照樣，較高的氨基酸態(tài)氮含量可以賦予白腐乳更加細(xì)膩、鮮美的口感，這可能與菌株ZH910具有一定的水解蛋白能力有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。菌株ZH910加入到毛霉型白腐乳發(fā)酵體系中，可明顯提升白腐乳品質(zhì)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從市售品牌白腐乳中篩選獲得了一株腐生葡萄球菌ZH910，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定其為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。研究發(fā)現(xiàn)，該菌株適宜在溫度15～40 ℃，初始pH 5～7的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃、最適生長(zhǎng)初始pH值為6；具有能夠耐受18%食鹽和6%vol乙醇的能力。常溫下，將該菌株接種至腐乳后熟體系中，經(jīng)過(guò)30～60 d的發(fā)酵，能夠顯著提升白腐乳氨基酸態(tài)氮含量和產(chǎn)品感官品質(zhì)，加快產(chǎn)香速度。為解決工業(yè)化純種生產(chǎn)模式下導(dǎo)致的白腐乳發(fā)酵體系中有益微生物缺失，風(fēng)味不足問(wèn)題提出了一種可行的方案。