貴州地區釀酒小曲細菌多樣性比較分析

唐佳代，邱樹毅，王春曉，吳鑫穎

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

小曲是以大米、米糠、麩皮等為原料，用于釀造生產甜米酒、黃酒、米香型、清香型和豉香型白酒的糖化發酵劑，根據形態不同可以分為塊狀小曲和散曲等[1-3]。小曲中微生物的群落組成和代謝決定了小曲酒的風味與品質，細菌在小曲中起著至關重要的作用，在發酵初期提供釀造所需的酸性環境，產生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等豐富多樣的酶系，且具有酯化、促美拉德反應和產生吡嗪類物質等能力，從而促進酒中多種風味物質的形成[4-9]。探究小曲中細菌多樣性，以此為基礎，研究釀酒小曲功能細菌并應用于釀酒是目前提高酒質和生產效率的手段之一。

早期關于酒曲中細菌多樣性的研究主要采用傳統的分離純化方法，該方法雖工作量大、分析速度慢[5-6]，只能獲得可培養微生物的部分信息，對于菌群結構的分析具有片面性，但獲得可培養微生物的生物學形態特征及生理生化性能對于功能細菌的篩選具有重要意義。隨著分子生物技術的發展，不依賴于培養的技術如聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）和高通量測序技術被應用于分析酒曲中微生物的群落結構。PCR-DGGE技術成本較低，但操作過程繁瑣，對技術人員要求較高，且無法實現大量樣本的同時檢測[10]。高通量測序技術安全性和可靠性高，能更為全面的表現樣品微生物豐度等優勢[11]。因此，近幾年，高通量測序技術開始應用于小曲中微生物群落結構的分析[6，12-15]。胡翠翠[14]利用高通量測序技術分析了黃酒曲中優勢細菌菌群，結果表明，黃酒曲中主要細菌菌群包括片球菌屬（Pediococcus）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、桿菌屬（Geobacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、鏈球菌屬（Streptococcus）、醋桿菌屬（Acetobacter）等20個屬；WU H等[12]利用高通量測序技術分析了中國華西、湖北、四川釀酒小曲的微生物群落結構，結果表明，共鑒定出17種細菌，其中的優勢細菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和穩桿菌屬（Empedobacter）；WANG J等[13]利用高通量測序技術分析了中國華西、湖北、四川傳統小曲中細菌的群落結構，結果表明，小曲中的細菌主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、Pediococcus、Weissella、芽孢桿菌屬（Bacillus）、Acetobacter、不動桿菌屬（Acinetobacter）和葡糖桿菌屬（Gluconobacter）。

本研究首次采用高通量測序技術結合傳統可培養分離方法對貴州5個地區（黔南州、遵義、盤州、威寧、興仁）代表性傳統釀酒小曲中細菌群落結構進行分析，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）對不同小曲樣品細菌群落結構的相似性進行分析，挖掘具有地域特色的功能細菌資源，以期為進一步利用和開發小曲微生物資源提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

小曲A：貴州威寧縣某酒廠生產塊狀釀酒小曲；小曲B：貴州盤州市某酒廠生產塊狀釀酒小曲；小曲C：貴州遵義市某酒廠生產塊狀釀酒小曲；小曲D：貴州黔南州某酒廠生產釀酒散曲；小曲E和F：貴州興仁市生產塊狀釀酒小曲。采集時間為2017年9月份，取樣后分別裝入密封袋，置于冰盒運回實驗室，分2份后分別保藏于4 ℃和-80 ℃。

1.1.2 試劑

營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基：上海博微生物科技有限公司；丙三醇（分析純）、無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；瓊脂糖H（生化試劑）：上海斯信生物科技有限公司；Loading Buffer：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

CX31RBSFA顯微鏡：日本東京奧林巴斯株式會社；SPX-250生化培養箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜：青島海爾股份有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；5424EQ766751離心機：德國Eppendorf公司；Block assembiy 96G PCR儀：德國Jena分析儀器設備股份有限公司；Bio-Bset140E 凝膠成像儀：美國西蒙國際公司。

1.3 方法

1.3.1 小曲中DNA提取、PCR擴增和測序

將保藏于-80 ℃的小曲樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進行脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取、PCR擴增及測序。具體操作：采用土壤微生物DNA強力提取試劑盒提取小曲樣品中的DNA，以其為模板對細菌16S rRNA的V3與V4區進行PCR擴增。PCR擴增引物為F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR擴增體系為引物F、R各1.5μL，基因組DNA 5 μL，KOD FX Neo 1 μL，buffer 25 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）10 μL，雙蒸水（ddH2O）補至總體系50 μL。PCR擴增條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共15個循環；72 ℃再延伸7 min。PCR擴增產物純化后用1.8%的瓊脂糖凝膠進行檢測，優質DNA片段進一步在Illumina HiSeq 2500測序平臺條件下進行高通量測序。

1.3.2 高通量測序數據處理與分析

高通量測序所得序列通過拼接、過濾、去除嵌合體，得到最終有效序列。利用定量洞察微生物生態學（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT），將相似度＞97%的序列定義為一個OTU，每個OTU對應于一種代表序列，并基于Silva分類學數據庫進行16S rRNA基因序列比對，進行分類學注釋。使用Mothur（version v.1.30）軟件在97%相似度水平下對樣品的Alpha多樣性指數進行分析，Alpha多樣性指數衡量指標包括超1（Chao1）、ACE、香農（Shannon）和辛普森（Simpson）指數[16]。采用R軟件繪制相對豐度熱圖，并在屬水平上進行熱圖聚類分析。采用PCA對不同小曲樣品細菌群落結構的相似性進行分析。

1.3.3 傳統小曲中細菌的分離純化及形態學鑒定

分別稱取10 g傳統小曲于250 mL三角瓶中，加入無菌水至終體積100 mL，加入玻璃珠后用透氣膜封口；室溫條件下150 r/min振蕩20 min；靜置后，取1 mL上清液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，將梯度稀釋液分別涂布于NA培養基上，37 ℃恒溫倒置培養1～2 d。待菌落長出后，計數，挑出單菌落在NA培養基上分離純化3～4次，觀察菌落形態，并在顯微鏡下觀察細菌細胞形態。

2 結果與分析

2.1 小曲細菌多樣性分析

6種小曲樣品的16S rRNA V3和V4區高通量測序結果經過濾和雙端拼接后，共得到369 734條優質序列，優質序列去除嵌合體后共得到365 169條有效序列，平均堿基長度為423 bp，得到2 181個OTU。為直觀展現各小曲樣品中的共有OTU和特有OTU，對所有小曲樣品的OTU進行統計和比較[17]，結果見圖1。由圖1可知，6種小曲樣品中共有的OTU數為65個。使用Greengenes細菌分類學數據庫對每個OTU的代表序列進行物種注釋，共注釋得到209個門、475個綱、750個目、1 269個科、2 049個屬和1 458個種水平的細菌。

圖1 6種小曲樣品OTU的統計和比較Fig.1 Statistics and comparison of OTU of 6 kinds of Xiaoqu samples

從6種小曲樣本中隨機抽取一定數量的序列，統計這些序列所代表的OTU數目，并以序列數與OTU數構建稀釋性曲線，結果見圖2。由圖2可知，小曲樣品A、B、C、D、E、F的稀釋性曲線先急劇上升，隨著測序序列數的增加后趨于平緩，說明在序列數增加前期細菌群落中有大量物種被發現；當序列數＞20 000個后，物種不再隨測序數量的增加而顯著增多；結果表明，6種小曲樣本測序量充分，測序結果能夠真實反映小曲細菌的群落結構和多樣性。

圖2 6種小曲樣品細菌OTU數稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterial OTU numbers in 6 kinds of Xiaoqu samples

利用Mothur軟件繪制Shannon指數曲線，結果見圖3。由圖3可知，所有小曲樣品的Shannon指數曲線都隨著測序序列數的增加趨于平滑，結果表明測序數據量充分，測序結果能夠真實反映小曲細菌的物種信息。

使用Mothur軟件評估6種小曲樣品細菌的Alpha多樣性。在97%相似度水平下，各小曲樣品Alpha多樣性指數測定結果見表1。由表1可知，Coverage數值越大表示樣本檢出率越高，6種小曲樣品的Coverage數值均＞0.997，說明樣本中物種被測出的概率較高，測序的結果能夠真實的反映樣品物種豐度及多樣性[18-19]。小曲D的Simpson指數最低，Shannon指數、Chao1指數和ACE指數均高于塊狀小曲，說明散曲物種分布均勻性最佳，物種豐富度及多樣性均高于塊狀小曲。5種塊狀小曲樣品中物種多樣性由高至低依次為小曲E＞小曲B＞小曲F＞小曲A＞小曲C，而塊狀小曲中物種豐富度由高至低依次為小曲A＞小曲B＞小曲E＞小曲F＞小曲C。

圖3 6種小曲樣品細菌Shannon指數曲線Fig.3 Shannon index curve of bacteria in 6 kinds of Xiaoqu samples

表1 6種小曲樣品細菌Alpha多樣性指數測定結果Table 1 Determination results of bacterial Alpha diversity index of 6 kinds of Xiaoqu samples

2.2 小曲細菌群落結構分析

2.2.1 基于屬水平小曲細菌群落結構分析

基于屬水平，對貴州6種小曲的細菌群落結構進行分析，結果見圖4，圖4中顯示豐度水平前十的物種，其他物種合并為Others。由圖4可知，在6種小曲樣品中主要含有的細菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）。各小曲樣品優勢細菌屬不同：小曲A中為Bacillus（55.04%）和Enterobacter（5.46%），小曲B中為Enterobacter（23.90%）、歐文氏菌屬（Erwinia）（18.15%）、Bacillus（17.32%）和Pediococcus（11.36%），小曲C 中為Lactobacillus（66.54%）和Pediococcus（4.67%），小曲D中為Bacillus（6.42%）、Lactobacillus（2.95%）和乳球菌屬（Lactococcus）（1.14%），小曲E中為Acinetobacter（10.33%）、Pediococcus（10.23%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（6.86%）和Lactococcus（5.12%），小曲F中為Pediococcus（37.88%）。

圖4 基于屬水平6種小曲樣品的細菌群落結構Fig.4 Bacterial community structure of 6 kinds of Xiaoqu samples based on genus level

2.2.2 基于種水平小曲細菌群落結構分析

基于種水平對貴州6種小曲的細菌群落結構進行分析，結果見圖5。由圖5可知，6種小曲樣品中均有大量的細菌無法在種水平上鑒別（樣品C、D、E、F中＞90%的細菌無法給出種水平的OTU），說明貴州傳統小曲中具有豐富的細菌資源尚未被開發，沒有列入高通量測序所使用的Greengenes數據庫中。在高通量測序能夠鑒別至種水平的細菌中，樣品A中的優勢細菌為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans），占58.46%；樣品B中的優勢細菌為Enterobacter cowanii和熱淀粉芽孢桿菌（Bacillus thermoamylovorans），分別占46.12%和13.35%；樣品C中的優勢細菌為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），占4.91%；樣品D中鑒定出細菌較少，優勢細菌為Cetobacterium somerae，僅占3.80%；樣品E和F中能夠鑒定至種水平的細菌豐度均＜1%。

圖5 基于種水平6種小曲樣品的細菌群落結構Fig.5 Bacterial community structure of 6 kinds of Xiaoqu samples based on species level

2.3 基于屬水平物種豐度聚類熱圖分析

與柱狀圖相比，相對豐度熱圖能更加直觀的反映出樣本間細菌群落多樣性的異同，相對豐度熱圖通過顏色梯度及相似程度來反映樣品群落結構的相似性[20]。基于屬水平，6種小曲樣品物種豐度聚類熱圖見圖6。由圖6可知，散曲D中多個物種豐度較高，小曲A中Bacillus豐度最高，小曲B中Enterobacter、Erwinia等5個物種豐度較高，小曲C中Lac-tobacillus和Weissella豐度較高，小曲E中Acinetobacter、Leuconostoc和Lactococcus等6個物種豐度較高，小曲F中Pedio coccus豐度最高。橫向聚類結果顯示小曲C與小曲F、小曲A與小曲B間物種豐度相似度較高，散曲D與傳統小曲間物種豐度相似度低。

圖6 基于屬水平6種小曲樣品物種豐度聚類熱圖Fig.6 Heatmap of species abundance clustering of 6 kinds of Xiaoqu samples based on genus level

熱圖中顏色代表物種豐度；縱向表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況，兩物種間距離越近，枝長越短，說明兩個物種在各樣品間的豐度越相似；橫向表示不同樣品的各物種豐度的相似情況，兩樣品間距離越近，枝長越短，說明這兩個樣品的各物種豐度越相似。

2.4 基于屬水平主成分分析

基于屬水平對6種小曲樣品的細菌群落結構的相似性進行PCA，結果見圖7。由圖7可知，細菌第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻率分別為48.14%、26.99%，兩個主要成分能夠解釋75.13%的物種差異。因此，采用PC1、PC2對6種小曲樣品的細菌群落結構的相似性進行PCA是可行的。小曲樣品A、B和D之間細菌群落結構相似，樣品E和F之間細菌群落結構相似，樣品C與其他5個小曲樣品明顯分離，說明樣品C與其他5個樣品細菌群落結構在屬水平上有較大差異。

圖7 基于屬水平6種小曲樣品細菌群落結構主成分分析Fig.7 Principal component analysis of bacterial community structure of 6 kinds of Xiaoqu samples based on genus level

2.5 小曲中細菌的分離及形態學鑒定

采用傳統可培養分離方法測定得到A、B、C、E、F 5種傳統塊狀小曲樣品中的細菌菌落總數分別為9.21×107CFU/g、1.15×107CFU/g、6.93×106CFU/g、1.17×106CFU/g和2.77×106CFU/g；小曲樣品A中可培養細菌菌落總數最多，小曲樣品B次之，小曲樣品E最少。通過分離純化，共得到84株細菌，根據形態學分類，A、B、C、E和F 5種傳統塊狀小曲中分離得到的細菌種類分別為5種、8種、2種、9種和6種。分離優勢菌株的菌落形態及細胞形態見表2。由表2可知，從小曲A、B、C中分離到的細菌主要為桿菌，而小曲E和F中分離出主要為球菌。

表2 傳統小曲中分離主要細菌的形態Table 2 Morphology of main bacteria isolated from traditional Xiaoqu

3 結論

該研究首次運用高通量測序法結合可培養分離法全面研究貴州地區小曲中細菌的多樣性。結果表明，散曲細菌多樣性及豐富度高于塊狀小曲，且塊狀小曲C最低；小曲A、B和D及E和F之間細菌群落結構相似；貴州地區釀酒小曲中優勢細菌屬為芽孢桿菌（Bacillus）、腸桿菌（Enterobacter）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）和不動桿菌（Acinetobacter）。通過傳統可培養分離方法從5種傳統塊狀小曲中共分離得到84株細菌，根據形態觀察，A、B、C、E和F 5種傳統小曲中分離得到的細菌分別為5種、8種、2種、9種和6種，為貴州小曲中功能細菌的研究應用奠定了良好基礎。