混菌發酵刺梨果渣風味組分及香氣特征的變化分析與評價

陳思奇，孟 滿，杜勃峰，肖仕蕓，丁筑紅

（貴州大學 釀酒與食品工程學院國家林業和草原局刺梨工程技術研究中心貴州省農畜產品貯藏加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）是薔薇科多年生落葉叢生灌木植物，其果實在食藥保健方面的獨特優勢備受關注并已被開發利用[1-2]。刺梨果渣是刺梨榨汁后的廢棄物，占鮮果的40%～50%，富含原刺梨果的多種營養及藥用功能成分[3]，具有很好的利用價值，但目前果渣綜合利用率低，浪費嚴重[4]。采用生物發酵技術對果渣的資源化利用已有研究報道，主要集中在合成營養素[5-6]、提高與改善膳食纖維[7-8]以及食品加工[9-10]、動物飼養[11-12]等方面。

前期研究發現，通過嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210和生香酵母混合菌種發酵刺梨果渣能夠明顯改善果渣膳食纖維理化特性，提高其功能活性[13]，該技術處理對果渣資源后續高值化利用及精深加工具有重要意義，但是其發酵后風味變化及香氣特征尚缺乏研究，而風味品質是發酵產品的重要屬性之一。因此，本研究首先采用定量描述性分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法對發酵前后刺梨果渣進行感官評定，然后采用頂空固相微萃取-氣質聯用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法對刺梨果渣混菌發酵前后香氣成分進行檢測分析，并根據不同香氣化合物閾值及相對氣味活度值（relative odour activity value，ROAV）確定各香氣成分對發酵果渣香氣特征的影響，對發酵前后香氣化合物的相對含量、種類差異性進行分析，初步明確刺梨發酵果渣香氣風格組成與產生變化的原因，為進一步探究發酵刺梨果渣中關鍵揮發性風味物質以及后續生物發酵資源化應用提供理一定理論依據，為刺梨果渣的高附加值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

刺梨：品種為貴農5號，采摘于貴州龍里縣，充分成熟。

1.1.2 菌種

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210：貴州輕化工中心；生香活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸鈉0.05 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，碳酸鈣20.0 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃、0.1 MPa滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

HP6890/5975C GC/MS聯用儀：美國安捷倫公司；SPX-150BⅢ型電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；LS-50HG立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫療設備有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；JYZ-E6T型九陽榨汁機：九陽股份有限公司；XMTD-204數顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；手動固相微萃取裝置：美國Supelco公司；2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纖維頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵菌種的培養

酵母菌活化：參照文獻[14]并進行改進。在酵母菌中按質量比1∶20加入溫水，使其均勻分散，然后加入5%的蔗糖，35～40 ℃條件下活化30 min，備用。

乳酸菌活化[13]：分別將嗜酸乳桿菌GIM.1.208、戊糖乳桿菌CICC.22210接種于MRS培養基中，37 ℃靜置培養24～48 h，備用。

1.3.2 混合菌種發酵刺梨果渣

挑選新鮮、無霉爛變質的刺梨，榨汁，出汁率為50%。取刺梨果渣50 g于500 mL三角瓶中，按料液比1∶5（g∶mL）加入蒸餾水，用棉塞塞緊瓶口，煮沸滅菌10 min，待其冷卻后按照體積比1∶2∶1接入嗜酸乳桿菌GIM.1.208、戊糖乳桿菌CICC.22210、生香酵母，接種量為10%，菌落總數（106～107CFU/mL），發酵溫度30 ℃，自然pH條件下置于生化培養箱發酵48 h，待測。

1.3.3 刺梨果渣香氣成分的檢測

采用HS-SPME-GC-MS法檢測刺梨果渣的香氣成分[15]。

固相微萃取條件：取樣品約15 g，置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在85 ℃條件下頂空萃取30 min后取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口，250 ℃條件下熱解吸3 min，進樣。

GC條件：色譜柱為ZB-5MSI彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序為初始溫度42 ℃，保留2 min，以4 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）；載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1.5 min。

MS條件：離子源為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 425 V；接口溫度280 ℃；選擇性離子監測掃描模式，掃描質量范圍20～450 amu。

定性定量分析：對總離子流圖中各峰經質譜計算機數據系統檢索、人工解析圖譜及與Nist2008和Wiley275質譜庫匹配，取匹配度＞80%并參考有關文獻進行定性，用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對含量。

1.3.4 感官評價

采用QDA法[16]，由6位相關專業經驗豐富的感官品評員（3名男性和3名女性）對刺梨果渣進行感官評價，獲得評價選用的主要感官描述詞。品評員被要求在描述詞上對刺梨果渣樣本按照5點標度法進行打分。0～5分別表示沒感覺、弱、稍弱、平均、稍強和強，取所得分值結果的平均值作感官評定雷達圖。

1.3.5 相對氣味活度值

參照文獻[17]中ROAV法評價各揮發性風味化合物對刺梨果渣總體風味的貢獻程度，確定關鍵風味物質。

1.3.6 數據處理

采用Origin2017和Excel2016軟件對實驗數據處理制圖。

2 結果與分析

2.1 刺梨果渣混菌發酵前后感官評價分析

采用QDA法對混菌發酵前后刺梨果渣的風味進行感官評定，結果見圖1。

由圖1可知，刺梨原果渣及混菌發酵后刺梨果渣的共同主要香型為果香、甜香、酸味、酒精味、澀味和酵母味。刺梨原果渣以果香、酸味、澀味為主；混菌發酵后的刺梨果渣以果香、酸味、酵母味為主。相較于刺梨原果渣，混菌發酵后，刺梨果渣果香、酵母味、酒精味、甜香得分有明顯提高，澀味得分降低，初步說明了刺梨果渣經過混菌發酵后產生了發酵特有的酵母味，且刺梨原果渣強烈的酸澀氣味得以改善，風味輪廓發生改變。

圖1 刺梨果渣混菌發酵前后感官評定雷達圖Fig.1 Radar chart of sensory evaluation of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multi-strain mixed fermentation

2.2 刺梨果渣混菌發酵前后香氣成分GC-MS分析

采用HS-SPME-GC-MS技術檢測刺梨果渣在混菌發酵前后香氣成分的變化，結果見圖2、表1及表2。

圖2 刺梨果渣混菌發酵前（A）后（B）香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before (A) and after (B) multi-strain mixed fermentation analyzed by GC-MS

表1 刺梨果渣混菌發酵前后香氣成分GC-MS分析結果Table 1 Results of GC-MS analysis of aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multistrain mixed fermentation

續表

續表

由表1及表2可知，從刺梨原果渣及混菌發酵后的刺梨原果渣中共同檢出107種揮發性香氣成分，其中烴類36種、醇類18種、酯類16種、酸類5種、醛類15種、酮類8種、其他類9種。從混菌發酵后的刺梨果渣中檢測出80種香氣成分，相對含量為92.071%，其中烴類、醇類、酯類、酸類、醛類、酮類及其他類香氣成分的相對含量分別為40.959%、14.483%、5.388%、14.404%、2.810%、3.646%、10.381%；從刺梨原果渣中檢測出79種香氣成分，其中烴類、醇類、酯類、酸類、醛類、酮類及其他類香氣成分的相對含量分別為52.398%、7.444%、2.600%、12.563%、8.511%、5.375%、8.031%。

表2 刺梨果渣混菌發酵前后香氣成分種類及相對含量Table 2 Types and relative content of aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multistrain mixed fermentation

2.3 刺梨果渣混菌發酵前后香氣成分變化

2.3.1 烴類香氣成分比較

烴類化合物的香氣閾值一般較高，除了可延長發酵果渣香氣留香時間外，香氣直接貢獻不大[18-19]?；炀l酵前后刺梨果渣中的烴類化合物數量及相對含量明顯高于其他種類化合物，其大部分為萜烯類和烷烴類物質，發酵前刺梨原果渣中的萜烯類物質主要包括β-瑟林烯、石竹烯、α-律草烯、β-羅勒烯、α-愈創烯、δ-杜松烯、α-蒎烯、β-欖香烯、α-蓽澄茄油烯、氧化丁香烯等，烷烴類物質主要包括十四烷、十五烷、十六烷、正壬基環己烷、姥鮫烷、植烷等。通過混菌發酵后，刺梨果渣中新檢出4-十三烯-6-己炔、甲苯、苯乙烯、α-松萜、十八碳烯、十九烷。

2.3.2 醇類香氣成分比較

醇類物質是微生物通過艾利希途徑將氨基酸作為底物轉氨脫羧再由醇脫氫酶還原而成[16]，此外，酵母也能從糖代謝的碳片段形成醇類[20]。醇類化合物可使果渣香氣濃厚豐滿，同時也是形成酯類化合物的前驅物質[21]，主要呈現清香和青鮮香氣[22]。刺梨原果渣經混菌發酵后，醇類物質相對含量由7.444%上升至14.483%，同時另檢出了異戊醇、壬醇、苯乙醇、植物醇。異戊醇與苯乙醇是酵母菌發酵的特有產物[23-24]，除本身具有愉快的風味外，還可作為其他易揮發性風味物質的溶劑[25]，對發酵果渣的風味具有雙重影響功能。經過混菌中生香活性干酵母發酵，乙醇相對含量增加，是混菌發酵后果渣產生酒精味的主要原因。

2.3.3 酯類香氣成分比較

酯類物質大多具有不同水果香氣[26-28]，閾值一般較低，是刺梨果渣整體香氣形成的重要組成部分?；炀l酵后，刺梨果渣中共檢出10種酯類化合物，包括苯二甲酸丁酯、棕櫚酸甲酯、異丁基鄰苯二甲酸酯、棕櫚酸乙酯、乙酸正十七烷基酯、油酸甲酯、亞油酸乙酯及油酸乙酯；而刺梨原果渣中共檢測出8種酯類化合物，分別為乙酸乙酯、碳酸乙酯、（Z）-3-己烯乙酸酯、辛酸甲酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯及乙酸正十七烷基酯。刺梨果渣經過混菌發酵后，酯類物質種類與相對含量增加，分析原因可能是由于醇類含量的增加提供了充足的前體物質，其次可能是因為混菌中的生香酵母菌發酵具很強的產香能力，尤以產酯香為主的香味物質最多[29]。乙酸乙酯的相對含量最高，賦予了發酵果渣濃郁的水果香氣。

2.3.4 酸類香氣成分比較

混菌發酵前后的刺梨果渣中均檢出辛酸，可以作為酯類物質的前體物質[25]，對果渣風味起到間接作用。但發酵后，辛酸含量降低，可能是由于辛酸與醇類合成酯類，導致含量下降，成為發酵果渣整體澀味減弱的原因之一[30]?；炀l酵后的刺梨果渣中還檢出了月桂酸、棕櫚酸、壬酸、發酸。

2.3.5 醛、酮及其他類香氣成分比較

醛、酮及其他類物質也是貢獻刺梨發酵物的特征香氣的重要揮發性成分，刺梨果渣在發酵前后均檢出3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-紫羅酮、橙化基丙酮、諾卡酮、2,6二（1,1-二甲基乙基）苯酚、二芐基硫醚、梅西呋喃、α-沉香呋喃、欖香素。醛類物質不穩定，在微生物作用下被還原為醇或被氧化為酸[31]，可能是發酵后刺梨果渣較原果渣對比，醛類相對含量減少，醇類、酸類相對含量增多的原因之一。

2.4 刺梨果渣發酵前后主要香氣成分相對氣味活度值分析

由于飽和烷烴類物質感覺閾值高，一般不易引起明顯嗅感[32]，為了進一步分析發酵刺梨果渣中主要風味組分的特征香氣物質，分別對混菌發酵前后的刺梨果渣中烯、醇、酯、酸、醛、酮類中主要香氣成分的ROAV進行計算分析，結果見表3。

由表3可知，混菌發酵后的刺梨果渣中（E）-2-癸烯醛相對含量較高，且閾值（0.3 μg/kg）較小，綜合呈味分析，其對發酵刺梨果渣的總體風味貢獻最大，定義其ROAV=100；發酵前刺梨原果渣定義辛醛的ROAV=100。

混菌發酵后的刺梨果渣中共有8種ROAV≥1的關鍵風味物質，其貢獻度大小為（E）-2-癸烯醛（100）＞3-甲基丁醛（15.32）＞壬醛（14.45）＞乙酸乙酯（9.65）＞α-蒎烯（2.29）＞2-甲基丁醛（1.42）＞苯乙醛（1.05）＞1-辛烯-3-醇（1.04）；（E）-石竹烯、1-戊醇、香葉醇、壬醇、苯乙醇對樣品總體風味具有重要修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。（E）-2-癸烯醛具有青香、脂香；壬醛具有玫瑰、柑橘等香氣；乙酸乙酯具有輕靈的果香，可知發酵后刺梨果渣具有輕靈的復合果香的特征?；炀l酵前的刺梨原果渣中共有8種揮發性物質的ROAV≥1，其貢獻度大小為辛醛（100）＞壬醛（31.09）＞3-甲基丁醛（25.36）＞2-甲基丁醛（8.91）＞1-辛烯-3-醇（4.75）＞正己醛（2.73）＞α-蒎烯（2.50）＞（E）-石竹烯（1.28）；1-戊醇、辛醇、香葉醇、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、正丁醛、正戊醛、2-庚酮對原果渣具有重要的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。飽和直鏈醛通常呈現出令人不愉快的、辛辣的、刺激性澀味[34]；3-甲基丁醛具有麥芽香氣[35]；α-蒎烯具有松木及樹脂樣氣息，可知未發酵刺梨果渣具有麥芽香、樹脂樣以及強烈刺激性澀味的特征。

表3 刺梨果渣混菌發酵前后主要香氣成分相對氣味活度值Table 3 Relative odour activity values of main aroma components of Rosa roxburghii Tratt pomace before and after multi-strain mixed fermentation

發酵前后刺梨果渣共有5種關鍵香氣物質，分別為3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、α-蒎烯、1-辛烯-3-醇，說明經過混菌發酵后的刺梨果渣與原果渣相似的關鍵風味組分較多，保留了松木樹脂樣及蘋果香等刺梨原果渣的特征性氣味。同時發酵后乙酸乙酯的ROAV較高，賦予了比原果渣更加強烈的輕靈果香；經過混菌發酵后，刺梨果渣飽和直鏈醛辛醛、壬醛的ROAV較低，使刺梨果渣刺激性氣味減弱，香氣更加柔和，可接受性更強，這和圖1感官風味輪廓果香得分增加，刺激性澀味得分降低趨勢相一致。

綜合分析可知，混菌發酵對刺梨果渣果香飽滿、香氣柔和、具有原刺梨果渣特征風味起了關鍵的貢獻，因而增加了風味協調性、香氣舒適性特征。

3 結論

采用嗜酸乳桿菌GIM.1.208、戊糖乳桿菌CICC.22210和生香酵母混菌發酵刺梨果渣，通過QDA法初步對刺梨果渣發酵前后的風味輪廓進行感官評定。結果表明，果香、酸味、澀味是刺梨原果渣的主要風味，而混菌發酵后的刺梨果渣具有獨特的酵母味，果味強度提高，酸澀刺激性氣味明顯降低。

通過HS-SPME-GC-MS從混菌發酵前后的刺梨果渣中共檢出107種揮發性香氣成分，其中烴類36種、醇類18種、酯類16種、酸類5種、醛類15種、酮類8種、其他類9種。經混菌發酵后，刺梨果渣的風味輪廓與發酵前明顯改變，刺梨果渣中醇類、酯類、酸類相對含量均增加，烴類、醛類、酮類減少?；炀l酵后刺梨果渣中ROAV≥1的關鍵風味物質有8種，其貢獻度大小為（E）-2-癸烯醛＞3-甲基丁醛＞壬醛＞乙酸乙酯＞α-蒎烯＞2-甲基丁醛＞苯乙醛＞1-辛烯-3-醇；原果渣中ROAV≥1的關鍵風味物質有8種，其貢獻度大小為辛醛＞壬醛＞3-甲基丁醛＞2-甲基丁醛＞1-辛烯-3-醇＞正己醛＞α-蒎烯＞（E）-石竹烯。發酵前后刺梨果渣中共有的關鍵物質有5種，分別為3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、α-蒎烯、1-辛烯-3-醇，說明發酵果渣保留了大部分刺梨果渣原本特征香氣物質，具有松木樹脂樣及麥芽香等刺梨原果渣的特征。發酵后乙酸乙酯的ROAV較高，飽和直鏈醛的ROAV較低，說明發酵后賦予了刺梨果渣更加濃厚的輕靈果香，且原有飽和直鏈醛產生的刺激性澀味減弱，在保留了刺梨原果渣特征風味的同時獲得了更加協調、柔和的風味特征。