不同菌種發酵對納豆激酶活性及黏液成分影響

牛紅紅，苗欣宇，李 達，遲燕平，劉佳彤，鄭 麗，蘇 穎，王景會

（吉林省農業科學院 農產品加工研究所，吉林 長春 130033）

納豆是黃豆經納豆菌發酵而成的豆制品。納豆菌別稱納豆芽孢桿菌（Bacillus natto），屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）納豆菌亞種[1-2]，是一種對人體非常有益的可食用益生菌。納豆菌在發酵納豆的過程中產生多種酶，在酶的作用下，黃豆不易被人體消化吸收的脂肪、蛋白質、碳水化合物等大分子物質，被轉化為更易被人體吸收的小分子營養成分，如氨基酸、有機酸、寡聚糖等[1-3]；同時產生納豆特有的活性成分，納豆激酶（nattokinase，NK）是一種絲氨酸蛋白酶，因具有治療心血管疾病、預防骨質疏松等多種保健功而效備受關注[4-5]。發酵合格的納豆表面有一層黏液，挑起時呈拉絲狀，具有納豆特殊的香味[6-7]。納豆黏液含有大量活性物質如NK、血管緊張肽轉化酶抑制劑、多糖等，具有抗腫瘤、溶栓、降壓、抗氧化等多種保健功能[8]，是評價納豆品質的一個重要指標[9]。

納豆菌影響納豆品質，NK活力、黏液營養物質，因此篩選發酵性能好的納豆菌至關重要。國內外很多學者以NK活力為評價指標，開展了納豆菌篩選和培育研究。KWON E Y等[10]首先通過纖溶活性篩選，再通過16S rRNA技術鑒定枯草芽孢；劉夢潔等[1]則將纖溶活性篩選和納豆激酶基因鑒定相結合，可準確篩選到NK高產菌株；張杰等[11]利用超聲波和紫外線對納豆菌進行復合誘變處理，篩選出NK高產突變菌株；LEE B H等[12]對比分析了4株枯草芽孢桿菌對納豆的發酵效果。關于納豆黏液成分組成，已開展了相關研究[13-14]，但是關于不同菌株對NK活力、納豆黏液各營養指標的影響，尚鮮見報道。

本研究以實驗室前期從不同地區、不同稻草中已經分離篩選的具有較好發酵性能的5株納豆菌為出發菌株，進行納豆發酵實驗，通過比較分析NK活力、納豆黏液中的營養，評價不同菌株發酵性能，以期為納豆生產用菌篩選提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

5株納豆菌（編號分別為JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214）：吉林省農業科學院農產品加工所食品微生物團隊保藏（分離菌株樣品分別來源于吉林省通化、公主嶺、通化、長春、遼源地區的稻草；5株菌產地、水稻品種不相同）；黃豆（小粒豆，吉林省通化市）：市售。

1.1.2 化學試劑

牛凝血酶（2000U/mg）、牛纖維蛋白原（純度＞85%）：沈陽拜英生物技術有限公司；注射用尿激酶標準品（1000IU/mg）：武漢人福藥業有限責任公司；瓊脂糖（分析純）：法國Biowest公司。酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

改良LB液體培養基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉3 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖3 g/L，pH 6.0～6.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

改良LB固體培養基：改良LB液體培養基添加16 g/L瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本Sanyo公司；3K15冷凍離心機：美國Sigma公司；Cary300紫外可見光分光光度計：美國Varian公司；2300 k凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司；S433D全自動氨基酸分析儀：德國Sykam公司；HZQ-X100全溫振蕩培養箱、DHP-9272電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；DL-CJ-2ND型超級潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及發酵液制備

菌種活化：將甘油管保藏的5株不同菌株，接種量2%，接入裝有50 mL改良LB培養基的100 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min搖瓶培養18 h。

發酵培養：取4 mL活化好的菌液轉接于裝有200 mL LB培養基的500 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min培養4 h即為發酵液。

1.3.2 納豆加工工藝流程

黃豆（精選去除雜物）→浸泡（12 h）→蒸煮及滅菌（100 ℃、2 h）→冷卻至室溫→接菌（接菌量4%）→發酵（37 ℃、18 h）→后熟（4 ℃冰箱，18 h）

1.3.3 分析檢測

（1）納豆黏液產率計算

參照劉晶等[15]的測定方法，稍作改動。

（2）納豆黏液成分測定

納豆黏液待測樣品制備：取100.00 g納豆，用100 mL生理鹽水，將納豆表面黏液全部清洗轉移至離心管中。分別測定納豆黏液中水分（直接干燥法[16]）、可溶性總糖（苯酚-濃硫酸法[17]）、總蛋白含量（凱氏定氮法[18]）、水解氨基酸及游離氨基酸（全自動氨基酸分析儀[19]，水解氨基酸用HCl水解法，游離氨基酸用磺基水楊酸法，儀器條件相同）。

（3）發酵液納豆活菌數的測定

采用稀釋平板法測定發酵液納豆活菌數[20]，稍作改動。改良LB平板，37 ℃恒溫靜置培養12 h，統計單菌落個數，計算納豆活菌數，控制發酵種子液活菌數在1.0×108～3.0×108CFU/g之間，以保持5株菌種發酵液活力一致。

1.3.4 納豆激酶活性的測定

納豆激酶活測定：參照瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定納豆激酶活性[21]，并作改進。

尿激酶標準曲線繪制：用生理鹽水將注射用尿激酶，分別配制成2 000 IU/mL、1 000 IU/mL、800 IU/mL、500 IU/mL、250 IU/mL尿激酶標準溶液，以尿激酶酶活對數值為橫坐標（x），尿激酶溶圈面積為縱坐標（y），繪制尿激酶標準曲線，得到回歸方程為y=0.223 5x+2.066 5，相關系數R2為0.997。

納豆激酶酶活定義：在37 ℃、1 min內水解纖維蛋白產生0.01 mm2透明圈的所需酶量為1個酶活單位（IU）[21]。

納豆樣品測定：納豆研磨均勻，取5.00 g，加入生理鹽水50 mL，37 ℃、180 r/min振蕩提取30 min，14 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液，其余與尿激酶標準曲線方法相同。由尿激酶標準曲線回歸方程計算出被測樣品的納豆激酶酶活力。

1.3.5 數據處理

采用Excel 2010進行數據統計及制圖，SPSS 17.0軟件中單因素方差方法，用Duncan多重比較對數據進行差異顯著性檢驗分析，以P＜0.05為差異顯著，數據以平均值±標準差的形式來表示。

2 結果與分析

2.1 不同菌種發酵納豆黏液產率及活菌數

不同納豆菌所產納豆中黏液產率及活菌數分析結果見表1。

表1 不同納豆菌發酵納豆黏液產率及活菌數Table 1 Yield and viable count of natto mucus fermented by different Bacillus natto

由于實驗采用同一種黃豆，接菌量及生產工藝相同，所以含水量相同[6]。在含水量相同的情況下，黏液產率不同，是由于發酵菌株不同造成的。因為納豆黏液是納豆菌從黃豆成分中降解、合成的，其產率和納豆菌數量及分泌各種酶的能力有關。納豆菌數量多、活性則高產酶能力強，黏液產率高，納豆感官濕潤、口感酥軟，品質較優。

由表1可知，納豆黏液的產率與所接的納豆菌種有關。5株菌種中，菌株JLGZL-018納豆黏液產率最高為（20.17±1.72）%，并與其他4株差異顯著（P＜0.05）。5株菌發酵的納豆活菌數在5.45×108～1.30×109CFU/g之間。其中，菌株JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157納豆樣品活菌數較多，均＞109CFU/g。因為納豆菌本身具有溶栓、降壓、抗炎等保健功能，所以活菌數是判定納豆品質的重要指標之一[7]。5株納豆菌由于來源不同，自身活性及生長性能不一致，所以在相同發酵條件下，活菌數也不同。其中菌株JLGZL-018，活菌數較多為1.23×109CFU/g，且黏液產率也最高，同時其他4株納豆菌也表現出黏液產率與活菌數量呈正相關。

2.2 納豆激酶活力檢測結果

由于NK是納豆生產過程中特有的一種酶，具有很強的溶栓效果，并且口服安全性高，是判定納豆產品品質的一個重要指標[7]。不同菌株發酵的納豆中所含NK的活性測定結果見圖1。

圖1 不同菌種對納豆激酶活性的影響Fig.1 Effect of different strains on nattokinase activity

由圖1可知，5株納豆菌發酵，NK活性在2086～4167IU/g之間，其中菌株JLGZL-018納豆樣品的激酶活性顯著高于其他菌株發酵納豆（P＜0.05），為4 167 IU/g。NK是納豆菌發酵過程中產生的一種蛋白酶，5株菌來源不同，其產生NK活力不同。同時從NK活力結果來看，活菌數、黏液產率較高的JLGZL-018菌株對應的NK活性較高，反之亦然，說明了NK活力與活菌數相關。已報道的商業化納豆產品中NK活力范圍一般在800～4 000 IU/g[22]，而菌株JLGZL-018生產的NK活力高于商業化NK活力水平，具有應用前景。

2.3 不同菌種發酵納豆對其黏液的影響

2.3.1 不同菌種發酵納豆對其黏液總蛋白含量影響

黃豆的蛋白質含量豐富，用黃豆發酵而成的納豆，蛋白含量幾乎與牛肉相當[6]。5種納豆菌發酵納豆黏液總蛋白含量測定結果見圖2。

圖2 不同菌種對納豆黏液性蛋白質含量影響Fig.2 Effect of different strains on protein contents in natto mucus

由圖2可知，菌株JLGZL-018發酵納豆黏液中總蛋白含量最高，達到（17.38±0.54）%，并與其他4株納豆黏液差異顯著（P＜0.05）；JLLY-214和JLTH-157納豆黏液蛋白含量分別為（13.68±0.20）%、（13.86±0.28）%，兩者之間差異不顯著（P＞0.05）；菌株JLCC-243和JLTH-075黏液總蛋白含量較低，分別為（9.57±0.38）%和（9.66±0.77）%，與其他3株菌黏液蛋白含量差異顯著（P＜0.05）。納豆黏液中的總蛋白是由納豆菌產生的豐富蛋白酶對黃豆蛋白分解產生的多肽、氨基酸等分子質量較小的含氮化合物，該類化合物有利于NK合成，提高納豆的品質。由于5株菌在發酵過程中產生的蛋白酶種類或者活性不同，所以納豆黏液中總蛋白存在差異。同時5株菌黏液蛋白含量高低與其對應的活菌數、NK活力趨勢基本一致。從黏液蛋白含量來看菌株JLGZL-018生產的納豆黏液中蛋白總量豐富、品質較高。

2.3.2 不同菌種對納豆黏液可溶性總糖含量影響

5種納豆菌發酵納豆黏液可溶性總糖含量測定結果見圖3。

納豆黏液中的可溶性總糖是納豆菌產生的淀粉酶、糖化酶等分解黃豆中化合物生成的。黏液中的總糖含量高，則黏液產率較高、納豆細膩綿軟，營養成分更易被吸收利用，納豆品質好。由圖3可知，5株生產的菌納豆黏液中可溶性總糖不相同，菌株JLGZL-018納豆黏液中可溶性總糖含量最高，為（5.21±0.13）%。并且在黏液產率、NK活力方面也均優于其他菌株，進一步說明該菌株活力好，分泌的酶能更好的把黃豆中的大分子碳水化合物降解、合成為黏液中的小分子可溶性總糖，其生產的納豆營養價值較高。

圖3 不同菌種對納豆黏液可溶性總糖量影響Fig.3 Effect of different strains on total soluble sugar contents in natto mucus

2.3.3 不同菌種對納豆黏液菌株水解氨基酸含量影響

黏液中氨基酸主要來源于納豆菌生產的蛋白酶對大豆蛋白的分解產物[23]。納豆中總氨基酸含量是判斷納豆發酵是否成功一個重要指標，也是納豆苦氨味的來源，黏液中含有大量氨基酸，所以分析其總氨基酸含量顯得十分重要[6]。不同納豆菌發酵納豆黏液水解氨基酸含量測定結果見表2。

表2 不同菌種對納豆黏液水解氨基酸含量影響Table 2 Effect of different strains on hydrolyzed amino acids contents in natto mucus g/100 g

由表2可知，納豆黏液中水解氨基酸含量豐富，16種氨基酸總量為（4.80±0.50）～（5.42±0.40）g/100 g，5株菌氨基酸總量之間差異不顯著（P＞0.05），菌株JLTH-157含量最高為（5.42±0.40）g/100 g，可能會產生較重的納豆苦氨味，JLGZL-018菌株氨基酸總量適中，為（5.34±0.27）g/100 g，7種人體必需氨基酸最高為（0.87±0.08）g/100 g，其中蛋氨酸和賴氨酸這兩種限制性氨基酸，含量最高分別為（0.03±0.01）g/100 g和（0.20±0.01）g/100 g，說明該菌株生產的納豆營養成分更理想。谷氨酸不但是重要的呈味物質，也是納豆黏液拉絲重要組成部分γ-多聚谷氨酸的合成前體，谷氨酸含量高，納豆黏液豐富、拉絲好、納豆風味濃郁[13-14]。5株不同菌種發酵的納豆黏液中谷氨酸含量為（0.51±0.15）～（0.64±0.17）g/100 g，之間差異不顯著（P＞0.05），以菌株JLTH-157含量最高為（0.64±0.17）g/100 g優于其他菌株。綜合水解氨基酸各指標來看，菌株JLGZL-018最具優勢，尤其是限制性氨基酸含量豐富。

2.3.4 不同菌種對納豆黏液游離氨基酸含量影響

研究表明，黃豆在發酵過程中，黃豆蛋白在微生物的作用下被分解成水溶性氮化物，其中游離氨基酸占水溶性氮化合物的10%[24]。因為游離氨基酸易被降解為對人體有害的生物胺[5，25]，并且其含量與納豆風味呈負相關，納豆產品中應控制游離氨基酸含量在適當的范圍，是納豆發酵工藝和產品質量控制的關鍵指標。不同菌種發酵納豆黏液游離氨基酸的含量測定結果見表3。

表3 不同菌種對納豆黏液游離氨基酸含量影響Table 3 Effect of different strains on free amino acid contents in natto mucus mg/g

由表3可知，從游離氨基酸種類及含量來看，5株菌差異不明顯。納豆黏液中游離氨基酸，總量為（3.10±0.09）～（3.36±0.10）mg/g，差異不顯著（P＞0.05），菌株JLGZL-018游離氨基酸總量最高為（3.36±0.10）mg/g；7種人體必需氨基酸總量為（1.83±0.05）～（2.02±0.19）mg/g，差異不顯著（P＞0.05），菌株JLTH-157含量最高為（2.02±0.19）mg/g；5株菌納豆黏液中谷氨酸含量為（0.11±0.03）～（0.12±0.02）mg/g，差異不顯著（P＞0.05），菌株JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214谷氨酸含量最高為（0.12±0.02）mg/g。結果表明，5株菌之間各有特點，性能差別不是很大。

3 結論

綜上所述，菌種來源不同，生產的納豆NK活力和黏液營養成分各方面有所差異。其中菌株JLGZL-018生產的納豆NK活力最高為4 167 IU/g，屬于NK高產菌株。黏液產率最高為（22.66±2.61）%；黏液中總蛋白、可溶性糖，含量最高分別為（17.38±0.54）%、（4.80±0.50）%；黏液中水解氨基酸中的必需氨基酸、限制性蛋氨酸、賴氨酸含量分別為（0.87±0.08）g/100 g、（0.03±0.00）g/100 g和（0.20±0.01）g/100 g均高于其他4株菌；在與納豆風味呈負相關的游離氨基酸含量方面，與其他菌株差別不明顯。綜合來看，JLGZL-018菌株無論是在NK活力實驗，還是黏液營養成分方面均具有明顯優勢，而且發酵性能較好，具有開發應用潛力，本研究可為高品質納豆生產用菌篩選提供依據。