釀酒酵母QY-1發酵過程中有機酸及游離氨基酸變化分析

馬巖石，姜 明，劉振艷，陳曉婷，裴芳藝

（齊齊哈爾醫學院 科研處，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

酵母菌是人類文明史上利用得最早的微生物，屬于兼性厭氧菌，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）利用最為普遍[1]。S.cerevisiae是一類用途廣泛、研究透徹的單細胞真菌，作為重要的生產用微生物，在醫藥、食品和生物能源等方面受到人們的倍加重視[2]。S.cerevisiae在以葡萄糖為底物的發酵過程中，營養物質除用于菌株生長所必需的蛋白質和核酸等合成外，還會產生一些中間代謝產物和副產物[3]。研究表明，S.cerevisiae作為模式生物，易于培養、繁殖迅速、代謝產物少、碳源利用率高以及可存活于較低pH環境，這也就意味著在有限的營養供應和相對惡劣的條件下能完成大規模的產物積累[4-7]。作為公認安全（generally regarded as safe，GRAS）微生物，S.cerevisiae遺傳操作技術成熟，蛋白質組學、轉錄組學和基因組學的有關理論研究較為清楚，而且自身具有完整的基因表達調控機制和對表達產物的加工后修飾能力，為S.cerevisiae的應用奠定了堅實的基礎[8]。與細菌相比，S.cerevisiae對各種環境制約因子耐受性強，安全無致病性，為工業化生產提供了更高的可行性。

中國作為食品生產大國，尤其是發酵食品、釀酒業在世界范圍內起到舉足輕重的作用。長久以來，S.cerevisiae作為釀酒工業的主要微生物，對我國酒精飲料制品的發展起到重要的影響[9]。乙醇作為S.cerevisiae的主要代謝產物，可以提高酒精飲料的品質[10]。S.cerevisiae在代謝過程中還可以產生有機酸和氨基酸，將其作為發酵劑或出發菌株應用于食品飲品領域，能改善發酵制品的風味和口感[11]。隨著生物技術的不斷發展，研究者通過多種手段解析S.cerevisiae的代謝途徑，從基因水平以及合成物學角度探究S.cerevisiae的產物合成機理，人為地改造菌株，獲得工業化產品[12-14]。然而，新型S.cerevisiae的分離篩選以及高產量代謝產物菌株的獲得仍是目前研究的工作重點[15]。

在先前的研究中，從東北葡萄果園中篩選出多株高產乙醇的菌株，并鑒定菌株的類別。本研究在此基礎上，以S.cerevisiaeQY-1為研究對象，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀和全自動氨基酸分析儀對其發酵過程中葡萄糖消耗量、乙醇生成量、有機酸及游離氨基酸（free amino acid，FAA）的種類及含量進行測定，研究菌株的發酵特性，為酵母的食品開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）QY-1：從東北葡萄果園中分離。

1.1.2 試劑

天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸標準品（純度均≥98%）：賽卡姆（北京）科學儀器有限公司；葡萄糖、乙醇、無水檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸、L-乳酸、甲酸、乙酸（純度均≥98%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）瓊脂培養基、YPD培養基：青島海博生物技術有限公司。

葡萄糖單碳源發酵培養基[16]：葡萄糖80 g，酵母提取物5 g，（NH4）2SO42.5 g，KH2PO42.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，無水CaCl20.25 g，蒸餾水1 L，調pH值至5.0，108 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Aminex HPX-87H有機酸和醇分析柱：美國Bio-Rad公司；S-433D全自動氨基酸分析儀：德國Sykam公司；Waters TMe2695型高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀：美國Waters公司；22331Hamburg高速離心機：德國Eppendorf公司；FE28 pH計：梅特勒-托利多集團；V-5000可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；BSP-400生化培養箱：上海博訊有限公司；SPH-110X12往復式恒溫振蕩水浴培養搖床：上海世平實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母QY-1的發酵

活化：將甘油管保藏的S.cerevisiaeQY-1接種于裝液量為20 mL/50 mL的YPD培養基中，30 ℃、140 r/min振蕩培養24 h，活化菌株。

種子液制備：將活化后的菌液分三區劃線于YPD瓊脂培養基平板上，30 ℃條件下靜置培養48 h。連續傳代培養3代后，分別挑取生長狀況優良的單菌落接種于裝液量為100 mL/250 mL的YPD培養基中，30 ℃、140 r/min振蕩培養24 h制備種子液。

發酵液制備：將種子液以5%（V/V）的接種量接種于葡萄糖單碳源發酵培養基中，30 ℃、140 r/min培養60 h，每隔6 h取適量發酵液，利用紫外分光光度計測定吸光度值（OD600nm值），利用pH計測定發酵液的pH值。

1.3.2 測定方法

（1）葡萄糖、乙醇及有機酸[17]

采用高效液相色譜法測定發酵液中的葡萄糖、乙醇和有機酸含量。HPLC條件：Aminex HPX-87H有機酸和醇分析柱（300 mm×7.8 mm），流動相為0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm。

標準曲線的繪制：配制不同質量濃度（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L）的葡萄糖、乙醇、無水檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸、L-乳酸、甲酸、乙酸等標準溶液，取標準品1 mL，用0.22 μm濾膜過后，采用HPLC法測定。以有機酸質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線。

發酵液中葡萄糖、乙醇和有機酸含量的測定：取發酵液1 mL稀釋100倍，13 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC法測定。

（2）游離氨基酸

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.3.3 數據處理

每個試驗均設置3個重復，數據以均值±標準差形式表示。利用JMP（Version 9.0.2）軟件進行方差分析及多重比較。采用Sigmaplot（Version 10.0）軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母QY-1的生長及pH值變化分析

圖1 釀酒酵母QY-1的生長狀況及pH值變化Fig.1 Growth situation and pH change of Saccharomyces cerevisiae QY-1

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，OD600nm值呈先急速上升后保持穩定的趨勢。在發酵0～24 h期間，釀酒酵母QY-1生長迅速；發酵24 h時，OD600nm值達到1.125±0.034；發酵24 h后，釀酒酵母QY-1生長進入穩定期。隨著發酵時間的延長，pH值與OD600nm值負向耦合，呈先急速下降后保持穩定的趨勢。在發酵0～24 h期間，pH值急速下降；發酵24 h時，pH值為3.87±0.08；發酵24 h后，pH值趨于穩定；發酵72 h時，pH值為3.81±0.04。因此得出，釀酒酵母QY-1在發酵過程中產生大量的有機酸，促使發酵體系的pH值降低。

2.2 葡萄糖和乙醇含量變化分析

圖2 釀酒酵母QY-1發酵過程中葡萄糖和乙醇含量的變化Fig.2 Changes of glucose and ethanol content during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation

由圖2可知，隨著發酵的進行，葡萄糖被不斷消耗，發酵54 h時，葡萄糖被消耗殆盡。而乙醇的生成量與葡萄糖消耗量負向耦合，呈先急速上升后略有下降最后保持平穩的趨勢，在發酵36 h時，乙醇含量最高，為（26.87±2.76）g/L。分析原因可能是，酵母菌在發酵過程中將α-酮戊二酸、丙酮酸和乳酸逐漸轉化為乙醇代謝中間產物，隨著發酵時間的延長，乙醇產量迅速提高。在發酵后期，由于營養物質消耗殆盡，酵母菌生長代謝活性降低，導致乙醇含量逐漸穩定。袁文杰等[18]利用HPLC法研究克魯維酵母（Kluyveromyces）菊芋發酵液中乙醇、糖和有機酸的變化情況發現，主要發酵產物為乙醇，主要副產物為乙酸、甘油和琥珀酸。

2.3 釀酒酵母QY-1發酵過程中有機酸及游離氨基酸變化分析

由圖3可知，隨著發酵的進行，有機酸含量呈現先升高后保持平穩的趨勢，在發酵72 h時達到最高，為（3.242±0.213）g/L。而游離氨基酸含量則呈先升高后降低的趨勢，在發酵24 h時達到最高，為（5.57±0.08）mg/L，此時有機酸含量為（2.364±0.101）g/L。在發酵72 h時，游離氨基酸含量為（3.68±0.11）mg/L，分析原因可能是發酵過程中菌體消耗了氨基酸[19]。酸類物質是酒精飲料中重要的風味物質，在酒精飲料中有增加濃厚感和減少甜味的作用，但是酸含量要適中，否則會影響酒精飲料的口感和風味[20]。游離氨基酸是酵母發酵過程中的主要可同化含氮物，對酵母菌的生長、碳源消耗和防止發酵停滯等均有重要影響[21]。在發酵食品以及酒精飲料中添加酵母菌，不僅可以有效地改善食品飲料的風味和口感，還可以提高食品飲料的營養價值。

圖3 釀酒酵母QY-1發酵過程中有機酸及游離氨基酸總量的變化Fig.3 Changes of total organic acid and total free amino acid contents during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation

為進一步研究釀酒酵母QY-1的發酵動態變化，對菌株發酵過程中有機酸及游離氨基酸的種類及含量進行分析，結果見表1及表2。

表1 釀酒酵母QY-1發酵過程中有機酸種類及含量的變化Table 1 Changes of types and contents of organic acid during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation g/L

由表1可知，在釀酒酵母QY-1的整個發酵過程中，共檢測到6種有機酸，包括檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、琥珀酸、L-乳酸和乙酸，沒有檢測到蘋果酸和甲酸。發酵12 h時，乙酸含量最高為（0.599±0.021）g/L，其次為丙酮酸（0.399±0.010）g/L；發酵24 h之后，檸檬酸和L-乳酸消失，各有機酸的含量從高到低依次為乙酸、丙酮酸、琥珀酸、α-酮戊二酸。檸檬酸是三羧酸循環中產生的少量中間代謝產物，很少甚至沒有被分泌到胞外，甚至有少量的檸檬酸會被酵母菌利用[16]，因此，在發酵24 h時消失。

由表2可知，在釀酒酵母QY-1發酵過程中，共檢測到17種游離氨基酸，谷氨酸含量最高，其次為甘氨酸，天冬氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量較少。氨基酸作為營養價值評價指標，不僅可以促進人體機體正常生長、修復組織、調節血糖，而且可以提供能量，對人體的健康起著重要作用。釀酒酵母QY-1發酵過程中包含人體所需的8種必需氨基酸，因此可以得出，釀酒酵母QY-1所產生的氨基酸種類齊全、營養豐富，可以應用于多種食品和飲料中，提高營養價值。

表2 釀酒酵母QY-1發酵過程中游離氨基酸種類及含量的變化Table 2 Changes of types and contents of free amino acid during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation mg/L

3 結論

本研究對釀酒酵母QY-1發酵過程中的OD600nm值、pH值、葡萄糖消耗量、乙醇生成量、有機酸及游離氨基酸種類及含量進行監控和分析。結果表明，隨著發酵時間的延長，釀酒酵母QY-1的OD600nm值呈現先升高后保持穩定趨勢，pH值呈現先急速下降后保持平穩的趨勢，pH值與OD600nm值呈負向耦合；乙醇的生成量與葡萄糖消耗量負向耦合；有機酸含量呈現先升高后保持平穩的趨勢，最高達（3.242±0.213）g/L，其中乙酸含量最高，其次為丙酮酸。游離氨基酸含量則呈現先升高后降低的趨勢，最高達（3.68±0.11）mg/L，其中谷氨酸含量最高，蛋氨酸含量最低。本研究結果不僅為篩選用于食品工業和釀酒工業的優勢菌株提供菌株來源，還為釀酒酵母的代謝過程研究提供理論支撐，同時為釀酒酵母功能性食品的開發和應用提供了基礎數據。