PCR-DGGE分析吉林市傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細菌的多樣性

左麗麗，高永欣，王舒然，富校軼

（吉林醫(yī)藥學院 公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林 132013）

本研究以吉林市農(nóng)家自制大醬為試材，在傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬發(fā)酵過程中，利用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)，結(jié)合分子生物學手段及相關(guān)軟件對不同發(fā)酵周期大醬中細菌的變化規(guī)律進行分析，通過研究該發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群及變化規(guī)律，為傳統(tǒng)發(fā)酵大醬的制作工藝及進一步研究其品質(zhì)及風味物質(zhì)的形成機理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)家大醬：采用東北傳統(tǒng)方法制成[13]。

甲酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylene diamine，TEMED）、尿素、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨：美國AMRESCO公司；氨芐青霉素、X-Gal、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；RNaseA：北京索萊寶科技有限公司；硫酸鎂、丙三醇、Tris-Base、冰乙酸、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸鈣：天津市大茂化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）：美國AMRESCO公司；瓊脂：北京金泰宏達生物科技有限公司。實驗試劑均為分析純。

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌通用引物27f、1495R、1492R、518R、338F（27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'；GC-338F：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'；518R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）：均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2×TaqPCR MasterMix：購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DWS高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；5430R型高速冷凍離心機、6331PCR儀：德國eppendorf公司；HZL-F100恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱：太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；FE20K pH計：METTLER TOLEDO公司；ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統(tǒng)、1645050電泳儀：美國BIO-RAD公司；GWA-UN4-C30超純水處理系統(tǒng)：北京普析通用儀器有限責任公司；JNOEC XS-212-201生物顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

采集1～10周不同發(fā)酵時期的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬各50 g，記錄發(fā)酵過程及時間等信息，置于10 mL滅菌離心管中，運回實驗室于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人們對生活質(zhì)量的要求越來越高，越來越多的人涌進城市，使得我國的城市化水平不斷提高。青島市作為我國經(jīng)濟發(fā)展迅速的城市，同時作為美麗的海濱城市，其人口城市化率每年都在提高（見圖1）。

1.3.2 豆醬總DNA的提取

稱取不同發(fā)酵周期一定質(zhì)量的豆醬，置于2 mL離心管中，離心去除大部分水分，用土壤基因組DNA快速提取試劑盒提取豆醬總DNA，測定DNA的濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[14-15]，置于-20 ℃保存。

1.3.3 16S rDNA PCR擴增

以上述提取的豆醬總DNA進行16S rDNA擴增，豆醬總DNA為模板，27F/1492R為引物，產(chǎn)物長度約為1 500 bp。PCR擴增體系：DNA模板1 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL、2×TaqPCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min[16-17]。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳驗證后，作為巢式PCR的模板。

以上述的PCR產(chǎn)物為模板，GC338F/518R為引物PCR擴增細菌16S rDNA V3可變區(qū)間，產(chǎn)物長度約為250 bp。PCR擴增體系與上述相同。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，65～55 ℃退火45 s（每個循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃延伸30 s，20個循環(huán)，94 ℃變性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，15個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳驗證，作為變性梯度電泳樣品。

1.3.4 變性梯度凝膠電泳

采用Bio-Rad公司的DGGE系統(tǒng)對上述PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分離分析。聚丙烯酰胺濃度為8%，變性梯度為35%～65%，電泳條件為1×TAE 緩沖液，恒溫60 ℃、恒壓80 V，電泳720 min[18-19]。電泳結(jié)束后分別用固定液、銀染液、顯色液洗滌，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 DGGE圖譜分析

利用凝膠系統(tǒng)自帶的軟件quantityone對DGGE的圖片進行分析，根據(jù)圖片中條帶的數(shù)量及灰度計算樣品的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H），Margalef豐富度指數(shù)（D）以及Pielou均勻度指數(shù)（E），對豆醬中細菌的多樣性進行分析[20]。

1.3.6 DGGE條帶的回收、克隆及測序

分別切膠回收DGGE圖譜中的優(yōu)勢條帶，加適量超純水過夜溶解片段，取上清液，以不帶GC夾板的引物338F/518R擴增細菌16S rDNA V3區(qū)。反應(yīng)體系及程序與帶GC夾板的一致。目標片段經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃冰箱保存，作為后續(xù)克隆的目的片段。采用pMD18-T Vector Cloning Kit克隆目的片段，挑陽性克隆子培養(yǎng)，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.7 乳酸菌16S rDNA同源性分析及種屬鑒定

登錄美國國立生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），對測序結(jié)果進行同源性分析，從數(shù)據(jù)庫中得到相關(guān)種屬的細菌16S rDNA序列信息。以16S rDNA的序列同源性＞99%為標準進行屬種歸類。然后再對待測菌株與模式菌株16S rDNA序列利用程序MEGA7.0中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步進行種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵大醬細菌16S rDNA、16S rDNA V3區(qū)PCR擴增結(jié)果

圖1 細菌16S rDNA（A）、16S rDNA V3區(qū)（B）PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rDNA (A) and 16S rDNA V3(B) regions gene of bacteria

以27F/1492R、GC-338F/518R 引 物PCR擴增細菌16SrDNA、16SrDNAV3區(qū)序列，分別得到大小約為1500bp、250 bp左右的目的片段，結(jié)果如圖1所示，說明目的片段擴增成功。

2.2 DGGE指紋圖譜分析

大醬發(fā)酵過程中1～10周細菌16S rDNA V3區(qū)變性梯度凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 豆醬發(fā)酵過程中1～10周細菌16S rDNA V3區(qū)DGGE指紋圖譜Fig.2 DGGE fingerprint of bacterial 16S rDNA V3 regions during fermentation process of 1-10 weeks of soybean pastes

DGGE圖譜中每一泳道條帶的數(shù)量代表菌落的遺傳多樣性，亮度強弱代表細菌數(shù)量的多少。由圖2可知，發(fā)酵前期1～5周各泳道的條帶數(shù)目相近，但各條帶的遷移率及亮度均有一定差異，說明發(fā)酵過程中，細菌的種類和數(shù)量發(fā)生了一定程度的變化。條帶①、⑤、⑧、存在于發(fā)酵的整個周期中，且亮度比較大，對應(yīng)的菌即為整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。條帶②、③、④只存在于泳道1、2和5中，其所對應(yīng)的菌可能是發(fā)酵前期帶入的雜菌，隨著發(fā)酵的不斷進行，菌體逐漸消失。條帶出現(xiàn)在發(fā)酵中后期，對應(yīng)的菌可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的優(yōu)勢菌。

2.3 細菌多樣性結(jié)果分析

表1 不同發(fā)酵周期豆醬中細菌菌群多樣性分析Table 1 Bacterial diversity analysis of soybean pastes at different fermentation periods

電泳圖譜中條帶多少可直觀反映豆醬樣品中細菌種群的遺傳多樣性，多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)及其分布均勻度的綜合指標。根據(jù)圖譜條帶信息，采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）、Margalef豐富度指數(shù)（D）以及Pielou均勻度指數(shù)（E）對細菌的多樣性進行分析，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，不同發(fā)酵周期豆醬中細菌的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)均表現(xiàn)出一定的差異，而均勻度則非常的接近。發(fā)酵第2周樣品具有較高的細菌豐度及多樣性，可能是由于發(fā)酵初期帶入的雜菌所導(dǎo)致。隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵中期（第5周后）時優(yōu)勢菌生長，保持菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。發(fā)酵后期，細菌豐富度指數(shù)在第9周達最高，但和中期差別不顯著。以上結(jié)果與DGGE圖譜的直觀結(jié)果一致。

2.4 測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

細菌DGGE圖譜中，選取15個標記的亮度高、分離清晰的條帶，經(jīng)過切膠回收、純化連接、克隆轉(zhuǎn)化、測序后，將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，測序結(jié)果如表2所示。由表2可知，在所測的15個條帶中得到的相似序列主要有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceu）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），是發(fā)酵周期的優(yōu)勢菌群，存在于發(fā)酵整個過程，而弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、不可培養(yǎng)的桿菌（Uncultured bacterium）存在于發(fā)酵的中后期，對后期大醬風味的形成起到一定的改善作用。

表2 DGGE優(yōu)勢條帶測序比對結(jié)果Table 2 Sequencing alignments results of dominate DGGE bands

MEGA7.0軟件構(gòu)建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹，NJ法自展數(shù)（bootstrap）為1000，結(jié)果如圖3所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，所有分離菌株與相應(yīng)的參考菌株同源性很高，并與其聚在一起，證明乳酸菌16S rDNA區(qū)域序列分析結(jié)果的準確性。

圖3 豆醬中細菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria in soybean pastes based on 16S rDNA

3 結(jié)論

本實驗利用PCR-DGGE技術(shù)分析吉林市農(nóng)家自制大醬不同發(fā)酵階段細菌的生物多樣性及變化規(guī)律，結(jié)果表明大醬發(fā)酵過程中細菌菌群種類較為豐富，有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceu）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、不可培養(yǎng)的桿菌（Uncultured bacterium）。其中戊糖片球菌、乳明串珠菌、葡萄球菌屬、屎腸球菌、解淀粉芽孢桿菌是發(fā)酵全程的優(yōu)勢菌，弗氏檸檬酸桿菌、霍氏腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、不可培養(yǎng)的桿菌為發(fā)酵后期優(yōu)勢菌。在整個發(fā)酵過程中乳酸菌相對較多，為發(fā)酵的優(yōu)勢菌群，對豆醬的風味起著主要作用。結(jié)合相關(guān)分析軟件表明，發(fā)酵過程中不同周期細菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)存在一定的差異，均勻度比較接近，通過系統(tǒng)發(fā)育樹可知，各細菌之間具有一定的親緣關(guān)系，這促進了傳統(tǒng)發(fā)酵大醬制作工藝的發(fā)展，為進一步品質(zhì)變化及風味物質(zhì)的形成機理提供理論支持，同時也為大醬的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。