解淀粉芽孢桿菌GUHP-86在口含煙煙草原料發酵中的提質降害研究

田永峰，楊 柳，董高峰，段沅杏，韓 熠，張 霞，趙 楊，王昆淼，朱瑞芝，陳永寬，帥 瑤，何臘平，繆明明，劉志華

（1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650000；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院 發酵工程與生物制藥省重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

口含煙是一種直接入口食用的新型無煙氣煙草制品，受到世界各煙草企業關注[1-2]。與傳統卷煙不同，口含煙是不經過燃燒直接放入口中吸食的[3]，其口感和沖擊強度直接受煙草原料的感官特性影響，因此口含煙制品對煙葉原料的品質要求更高。

微生物發酵是改善口含煙煙草原料品質的有效手段[4-6]。近年來，國內外研究均發現采用人工控制微生物發酵技術可以消除煙葉的青雜氣和減輕刺激性，使煙葉香氣質和香氣量變佳[7-8]或降解煙草中有害物質[9-10]等。此外，微生物代謝過程中往往會產生對人體有益的功效性成分，如有助于消化的蛋白酶、可以溶解血栓的納豆激酶（nattokinase，NK）[11-12]等。因此接種合適的功能微生物于煙葉中發酵不僅可從感官上增香提質，同時還能產生一些可大大提高口含煙食用價值的功能活性物質。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種非致病性益生菌[13]，可用作多種食品工業酶的生產菌株[14]，能產生一系列抑制真菌和細菌活性的自身代謝產物，如多種消化酶、抗生素、抗菌蛋白或多肽類物質等[15-16]，已廣泛應用于食品生產、水產養殖及蔬菜保鮮等眾多領域[17-20]?；诖?，初次采用實驗室篩選出的具有優良產納豆激酶和蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌GUHP-86對口含煙煙草原料進行人工控制接種發酵，考察發酵前后煙草原料成分的改變，并進一步考察發酵過程中產酶情況及降低煙草中亞硝酸鹽的情況，為解淀粉芽孢桿菌在煙草發酵中的提質降害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口含煙煙草原料大理紅大CL314：云南中煙工業有限責任公司；纖維蛋白原、水楊苷：美國Sigma公司；福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為色譜純或分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）GUHP-86：保藏于中國典型培養物保藏中心（保藏編號CCTCC M 2016003）。

發酵培養基：胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 10 g、葡萄糖1 g，補充蒸餾水至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

有糖鹽溶液：準確稱取MgCl20.5 g、KCl0.5 g、CaCl20.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，補殼蒸餾水至1 000 mL，溶解滅菌后備用。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀（gaschromatographymass spectrometry，GC-MS）（配PAL3多功能自動進樣器）：美國Agilent公司；BSA124S-CW型電子天平：德國sartorius公司；A10超純水機：美國Millipore公司；Q/YXLZ82 分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SPX恒溫生化培養箱：上海科恒實業發展有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 煙葉發酵

發酵培養基中接入解淀粉芽孢桿菌GUHP-86于37 ℃、180 r/min培養18 h，取出后置于滅菌的離心管內，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清，加入無菌生理鹽水至20 mL，搖勻。稱取20 g煙葉于密封袋內，吸取4 mL（即接種20%）離心管內的菌液、4 mL有糖鹽溶液，直接加入煙葉中，充分混勻，于37 ℃培養箱內發酵培養15 d，每天對其進行換氣。

1.3.2 酶活力測定

精確稱取磨碎的發酵煙草樣品1 g于燒杯中，用25 mL磷酸鹽（phosphate buffer saline，PBS）緩沖溶液浸提24 h，然后用慢速定性濾紙過濾，濾液待用。納豆激酶活力用紫外分光光度法測定[21-22]。蛋白酶活力參照GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》[23]進行測定。

1.3.3 亞硝酸鹽測定

精確稱取3.0 g磨成粉末狀的發酵煙葉樣品，置于250 mL錐形瓶里，加入10 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，加入蒸餾水150 mL，70 ℃水浴加熱30 min后過濾，濾液轉入250 mL容量瓶中，在旋轉的同時加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻并加入5 mL醋酸鋅溶液，以沉淀蛋白質。加水至刻度，搖勻后過濾，濾液備用。參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法進行亞硝酸鹽測定。

1.3.4 揮發性成分GC-MS分析

將2 g發酵煙草樣品放入10 mL頂空固相微萃取瓶，配50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取條件為70 ℃保持5 min，70 ℃吸附30 min。待萃取結束后，在GC進樣口解吸，解吸溫度250 ℃，時間5 min。

GC-MS條件：DB-wax毛細管柱（60m×0.25mm×0.25mm）；進樣口溫度：240 ℃；載氣：氦氣（He），流速1.5 mL/min；分流比2∶1；升溫程序：初始溫度40℃，保持1min，以10℃/min升至120 ℃，保持1 min；以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。傳輸線溫度：240 ℃；電離方式：電子電離源（electron ionization，EI）；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：33～350 amu；數據采集模式：全掃描。采用美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）譜庫檢索定性。

1.3.5 數據分析

利用SPSS version 19.0進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 GUHP-86發酵煙絲揮發性物質的變化

采用GC-MS考察了菌株GUHP-86接種煙葉發酵前后揮發性物質的變化，結果見表1。

由表1可知，發酵后口含煙草的揮發性物質的種類及相對含量均發生了變化。發酵后煙葉中出現了新的物質如哌啶類和喹啉類，而嘧啶類物質消失，酮類、烴類含量基本不變，醇類、醛類、烷烴類物質明顯增加，但酯類含量稍有降低，酸類物質大幅度減少。發酵后煙葉中消失了一些成分，如植醋酸、糠醇、丁內酯、乙酸、大馬酮等，但也產生了一些成分，如2-哌嗪酮、3-羥基-N-甲基哌啶、鄰苯二甲酸、4-嘧啶酮、有鮮清甜香的苯乙醛、植醇，具有果香和酒香香氣的癸酸乙酯，具有柑橘和檸檬似香氣的萜品烯等。發酵后醇類物質的相對含量大大增加，主要表現為植醇的增加，而植醇是具有芳香氣味的物質。此外，酸類物質含量大大降低，酸在口腔中呈味作用主要表現在貢獻H+使人感覺到酸味覺，并同時有酸刺激感覺。作為在口腔中食用的口含煙，酸含量的下降會提高其食用的舒適感，降低刺激性。其他種類如酮類、醛類、酯類、烯烴類等的變化不大。

表1 發酵前后煙草揮發性物質比較Table 1 Comparison of volatile substances in tobacco before and after fermentation

2.2 發酵煙葉納豆激酶活力測定

自然發酵煙葉和菌株GUHP-86發酵煙葉的提取液在纖維蛋白平板的水解效果見圖1。由圖1可見，自然發酵的煙葉沒有水解圈，只有發酵煙草樣品提取液顏色擴散所產生的顏色圈，而經菌株GUHP-86發酵的煙葉出現了水解圈，說明菌株GUHP-86在煙葉發酵過程中可以產納豆激酶，由紫外法測得納豆激酶活力為（10.53±0.21）FU/g。納豆激酶（nattokinase，NK）是一種蛋白激酶，具有溶解血栓，降低血黏度等作用[24]。煙葉發酵后納豆激酶的產生無疑可以提高口含煙的食用價值。口含煙發酵后產納豆激酶，國內外還未見報道。

圖1 自然發酵煙葉（a）、菌株GUHP-86發酵煙葉（b）的提取液在纖維蛋白平板上的水解效果Fig.1 Hydrolysis effect of extracts from naturally fermented tobacco leaves (a) and GUHP-86 fermented tobacco leaves (b) on fibrin plate

2.3 菌株GUHP-86發酵煙葉中蛋白酶活力測定

自然發酵煙葉酶提取液（a）和菌株GUHP-86發酵煙葉酶提取液（b）在酪蛋白瓊脂培養基上水解效果見圖2。由圖2可見，自然發酵的煙葉水解圈較小，而經菌株GUHP-86發酵的煙葉出現了明顯的水解圈并且較未發酵煙葉水解圈更大，說明菌株GUHP-86在煙葉發酵過程中可以產蛋白酶。蛋白酶是催化蛋白質水解的一類酶，可以促進煙葉中蛋白質的水解和進一步形成煙草致香物質，從而提高煙草品質[25]。同時蛋白酶也有助于人體消化。由福林-酚試劑法測得菌株GUHP-86發酵煙葉中蛋白酶酶活為54.45 U/g。

圖2 自然發酵煙葉（a）、菌株GUHP-86發酵煙葉（b）的酶提取液在酪蛋白平板上的水解效果Fig.2 Hydrolysis effect of enzyme extracts from naturally fermented tobacco leaves (a) and strain GUHP-86 fermented tobacco leaves (b) on casein plate

2.4 菌株GUHP-86降亞硝酸鹽性能測定

煙草中特有的亞硝胺（tabacco-specific nitrosamines，TSNA）是煙葉中重要的有害成分。TSNA 的形成普遍認為是由煙草中的生物堿和亞硝酸鹽反應形成的，因此亞硝酸鹽是生成TSNA的前體物之一，降低煙葉中亞硝酸鹽含量有助于降低TSNA含量，提高口含煙的食用安全性。菌株GUHP-86屬于芽孢桿菌屬，國內外大量研究表明，芽孢桿菌對亞硝酸鹽及硝酸鹽有很好的去除效果[26-27]。

由圖3可以看出，經菌株GUHP-86處理的煙葉（a）發酵21 d后，亞硝酸鹽含量下降了73%；而自然發酵煙葉（b）中亞硝酸鹽含量僅下降了18%，降亞硝酸鹽性能差異顯著（P＜0.05），說明解淀粉芽孢桿菌GUHP-86具有良好的降解亞硝酸鹽作用，其機理可能是發酵過程中GUHP-86產生了亞硝酸鹽還原酶將亞硝酸鹽降解和被生物利用。自然發酵煙葉在發酵過程中亞硝酸鹽也下降了18%（P＜0.05），其原可能因為煙葉表面本身含有一定微生物，對亞硝酸鹽本身也有一定的降解作用，但降解率較GUHP-86弱很多。

圖3 煙葉發酵過程中亞硝酸鹽含量變化曲線Fig.3 Change curve of nitrite content during the tobacco leaves fermentation

3 結論

將解淀粉芽孢桿菌GUHP-86用于口含煙煙葉原料的發酵，GC-MS檢測發現發酵消除了煙葉中一些成分但又新增一些成分，其中醇含量大大提高，酸含量顯著下降。此外，發酵后煙草原料中的納豆激酶、蛋白酶含量得到提升，而亞硝酸鹽含量降低了73%。說明將解淀粉芽孢桿菌GUHP-86用于口含煙煙草原料發酵能一定程度地提高其口含煙產品的食用舒適性和食用安全性。尤其是口含煙發酵后產納豆激酶，國內外目前未見報道，富含納豆激酶的口含煙可顯著提高口含煙的功能價值。