豆醬生產菌株米曲霉ZJGS-LZ-12的分泌蛋白組學研究

劉 曄，朱媛媛，馮 緯，周利南，梁新樂

（1.杭州市食品釀造有限公司，浙江 杭州 310021；2.浙江五味和食品有限公司，浙江 湖州 313213；3.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

豆醬是我國傳統特色調味品，其作為發酵豆制品，不僅滋味鮮美、富含蛋白質，而且還含有異黃酮、多酚及類黑精等生理活性物質[1-2]，廣受消費者的喜愛。現代工業化生產豆醬主要依賴于米曲霉培養過程中產生的蛋白酶、淀粉酶等分解原料中的蛋白質、淀粉類成分，形成多肽、氨基酸和糖類等物質，從而獲得豆醬獨特的風味[3-4]。

目前，國內釀造醬企業，普遍采用米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042作為發酵菌株，其具有蛋白酶活力高，生長快、安全等特點[5]。豆醬發酵環境的pH值一般在4.6～5.0之間，屬于偏酸性環境，在此發酵條件下，中、堿性蛋白酶活力受到抑制，對原料蛋白質分解利用不徹底。因此，選育高產酸性蛋白酶菌株有利于豆醬的發酵[6-7]。鑒于豆醬發酵主要是由米曲霉分泌的水解酶起作用，因此，對于米曲霉胞外分泌蛋白的研究將有利于探究豆醬發酵的機理以及篩選優良菌種。ODA K等[8]首先運用雙向凝膠電泳（twodimentional electrophoresis，2-DE）技術比較了米曲霉RIB40在固體和液體培養條件下胞外蛋白的分泌情況，共鑒定出29種蛋白，包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、肽酶以及纖維素降解酶等；LIANG Y C等[9]利用單向電泳技術研究了A.oryzae3.042在大豆制曲過程中胞外蛋白圖譜，并結合基質輔助激光解吸電離-飛行時間/飛行時間-質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）技術鑒定出多種和大豆水解相關的蛋白酶；ZHANG B等[10]運用2-DE技術研究了紹興米酒曲中米曲霉分泌的蛋白質組，共鑒定出41個蛋白，在2-DE圖譜上，70%的蛋白質屬于淀粉酶及其水解產物；ZHAO G Z等[5]運用2-DE技術對A.oryzae3.042和突變株A100-8的胞內蛋白的蛋白質組學進行了比較研究，共鑒定出522個蛋白點，其中451個為差異蛋白點，且參與糖酵解、氨基酸合成代謝、次級代謝過程的蛋白與釀造醬油的風味相關，在蛋白組水平揭示了菌株A100-8發酵醬油風味比米曲霉3.042好。

本研究采用從種曲車間分離得到的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶及糖化酶活力較高、產酶特性較好、不產生黃曲霉毒素的米曲霉ZJGS-LZ-12為研究對象，以米曲霉3.042為對照，采用2-DE技術研究米曲霉ZJGS-LZ-12與3.042的分泌蛋白組差異，確證米曲霉ZJGS-LZ-12的酶學輪廓及其在豆醬中的工業價值，為該菌株的后期應用及工業米曲霉菌種的發酵酶學研究提供重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：實驗室保存；米曲霉ZJGS-LZ-12：浙江五味和食品有限公司種曲車間分離，實驗室保存。

1.1.2 試劑

硫脲、尿素、溴酚藍（均為分析純）、固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）膠條（pH 4～7）：美國Bio-Rad公司；非變性兩性離子去垢劑、蛋白酶抑制劑：中國BIOSHARP公司；考馬斯亮藍G-250：德國Sigma公司；無水乙醇、甲醇（均為分析純）：杭州化學試劑有限公司；磷酸（分析純）：上海凌峰化學試劑有限公司；丙酮（分析純）：杭州雙林化工試劑廠；乙酸（分析純）：江蘇強盛功能化學股份有限公司；硫酸銨（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

豆汁斜面培養基：豆汁1 000 mL，可溶性淀粉20 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，（NH4）2SO40.5 g，瓊脂20 g，自然pH，115 ℃滅菌30 min。豆汁：按豆粕質量加5～6倍水，煮沸1 h，過濾，每100 g豆粕制成5 Bé 豆汁100 mL。

麩皮固體培養基[11]：麩皮80 g，面粉20 g，蒸餾水80 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

Protean IEF cell等電聚焦電泳儀、PowerPac Universal垂直板電泳儀、Protean II xi電泳灌膠模具、GS-800高分辨專業掃描儀、PDQuest 8.0雙向電泳圖像分析軟件、Mini-Protein cell II電泳系統：美國Bio-Rad公司；Biofuge stratos臺式冷凍高速離心機、Forma 702超低溫冰箱：美國Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水裝置系統：美國Millipore公司；AF-10制冰機：美國Scotsman公司；Eppendorf移液槍：德國Eppendorf公司；DELTA 320標準型pH計：瑞士Mettler Toledo公司；4800 MALDI-TOF/TOF-MS儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 種曲的制備

米曲霉的活化：在無菌條件下，用接種環挑取米曲霉孢子接種到豆汁斜面培養基上，30 ℃條件下恒溫培養3～5 d。

種曲的制備：在無菌條件下，用接種環挑取斜面菌種轉接于麩皮固體培養基，搖勻，30 ℃條件下恒溫培養18～20 h，搖勻，繼續培養6 h，搖勻，繼續培養至72 h，米曲霉生長成熟，即為豆醬種曲。

1.3.2 米曲霉胞外蛋白的提取與處理

胞外蛋白提取：稱取25 g新鮮的種曲樣品于500 mL三角瓶，加入50 mL胞外蛋白提取劑（含1‰蛋白酶抑制劑的0.05 mol/L乙酸緩沖液），輕輕搖晃，使曲料完全浸入提取液中，置于4 ℃冰箱中靜置12 h。浸提完成后，首先用8層紗布過濾除去曲料中的麩皮、豆粕等物質，然后將得到的蛋白濾液在4 ℃、13 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，同樣條件下離心10 min，以除去濾液中不溶的雜質。離心后的上清液經0.45 μm的濾膜過濾，即為米曲霉胞外蛋白，于-80 ℃冰箱貯存備用。

胞外蛋白處理：參照文獻[12]的方法，并稍加改動，對胞外蛋白進行處理。按照體積比1∶4向胞外蛋白樣品中加入-20 ℃預冷的丙酮，混勻，于-20 ℃條件下靜置2 h，混勻，于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，同樣條件下離心1 min，棄丙酮液體。沉淀物用氮氣吹干，加入適量的裂解液（尿素12 g，硫脲3.8 g，非變性兩性離子去垢劑1 g，無菌水25 mL），間隔振蕩至沉淀溶解，于4 ℃、15 000 r/min條件下離心1 min除去不溶物。

蛋白含量的測定：采用Bradford蛋白定量法[13]對樣品蛋白濃度進行定量。

1.3.3 雙向電泳

第一向是等電聚焦，選用pH 4～7的IPG膠條水化上樣，考染，蛋白上樣量400 μg、上樣體積300 μL，在等點聚焦程序II（延長除鹽時間（5 h）和聚焦時間（80 000 vhr））條件下進行2-DE實驗。第一向完成后，取出膠條，轉移到聚丙烯酰胺凝膠上進行第二向電泳。電泳完成后，采用PDQuest專業圖像分析軟件分析比對2-DE圖譜，比較不同組間的蛋白點。如果某一蛋白點的表達量的相對比值≥1.5或≤0.5，且P＜0.05，則將該點判定為差異表達蛋白點。當某個蛋白點的表達量的相對比值≥1.5時，為分泌表達量上調；當蛋白點的表達量的相對比值≤0.5時，為分泌表達量下調。

1.3.4 差異蛋白點的質譜鑒定

參照文獻[8]的方法對差異蛋白進行鑒定。質譜條件：采用反射模式采集每個蛋白質的一級質譜（MS）信息，激光強度4 000，質量范圍800～4 000 Da。一級質譜掃描完成后，選取7個信號強度最高的母離子進行二級質譜（MS/MS）分析，加速電壓2000 V，采用誘導碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）碰撞裂解母離子，獲取每個母離子的離子碎片指紋譜。

定性分析：MS及MS/MS數據通過MASCOT軟件中的applied biosystems對美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）和Uniprot蛋白質數據庫進行檢索。檢索參數為：米曲霉、胰蛋白酶酶解、最大漏切位點1個，固定修飾方式：半胱氨酸脲甲基化進行固定修飾、甲硫氨酸氧化進行可變修飾，肽段質量精確度±0.3 Da，置信度＞95%具有統計學意義。

1.3.5 差異蛋白點的生物信息學分析

利用生物信息學手段對鑒定的米曲霉蛋白進行預測和分析。使用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）[14]預測信號肽、UniProt（http：//www.uniprot.org/uniprot/）[15]和QuickGO（http：//www.ebi.ac.uk/QuickGO/）數據庫預測蛋白質的結構和功能。通過ExPASy的pI/MW工具（http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html）[16]獲得蛋白質的理論等電點和分子質量。通過WoLFPSORT program（http：//wolfpsort.org/）[9]對蛋白質的亞細胞進行定位。

2 結果與分析

2.1 米曲霉ZJGS-LZ-12胞外蛋白質分泌量的檢測

比較米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12在種曲中胞外蛋白質的分泌量，結果見圖1。

圖1 米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12胞外蛋白質的分泌量Fig.1 Secretion volume of extracellular proteins by Aspergillus oryzae 3.042 and ZJGS-LZ-12

由圖1可知，米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12胞外蛋白質的分泌量分別為（175.78±6.07）μg/g干曲和（183.52±23.07）μg/g干曲。結果表明，兩株米曲霉的胞外蛋白分泌能力相當。

2.2 米曲霉ZJGS-LZ-12分泌蛋白組的雙向電泳圖譜及差異蛋白質分析

米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12的胞外蛋白雙向電泳圖譜見圖2。

圖2 米曲霉3.042（A）及ZJGS-LZ-12（B）分泌蛋白組的雙向電泳圖譜Fig.2 Two dimentional electrophoresis pattern of secretome of Aspergillus oryzae 3.042 (A) and ZJGS-LZ-12 (B)

由圖2可知，經PD Quest軟件進行定性、定量分析，在米曲霉3.042和ZJGS-LZ-21的2-DE圖譜上分別檢測到552±21和586±18個蛋白點，與米曲霉3.042相比，具有統計學意義的差異表達蛋白點共有169個（P＜0.05），其中80個蛋白點分泌表達量下調，89個蛋白點分泌表達量上調。對169個差異表達蛋白點進行質譜鑒定及數據庫檢索，結果有105個蛋白點被鑒定成功，占總蛋白點數的62.1%。根據蛋白點的肽指紋圖譜，共檢索到27個差異蛋白質。結合NCBI和Uniprot數據庫，對鑒定的蛋白質進行QuickGO蛋白功能聚類分析，結果見表1。其中3個蛋白（Q9HGY9、Q2ULB2及P80402）不屬于分泌蛋白，不予以分析。

表1 米曲霉ZJGS-LZ-12和3.042胞外差異表達蛋白的鑒定Table 1 Identification of extracellular differential proteins expressed by Aspergillus oryzae ZJGS-LZ-12 and 3.042

續表

2.3 米曲霉ZJGS-LZ-12差異蛋白質生物功能性分類及解析

A.oryzae3.042和ZJGS-LZ-12胞外差異表達蛋白質的功能性分類見圖3。由圖3A可知，差異蛋白質主要參與糖類和蛋白質水解過程，分別占總蛋白質的65.22%和26.09%；4.35%的蛋白質參與氧化還原等過程。由圖3B可知，差異蛋白質主要是水解淀粉、纖維素、半纖維素及蛋白質的酶。其中，66.6%淀粉水解酶和75%半纖維素酶分泌表達量上調，33.3%淀粉水解酶和25%半纖維素酶分泌表達量下調；33.3%蛋白酶和肽酶分泌表達量上調，其余分泌表達量下調；纖維素酶及氧化還原酶分泌表達量均下調。結果表明，大部分蛋白酶參與糖類和蛋白質的分解代謝，與制曲過程中胞外蛋白變化相一致[8]。分析原因可能是在固態發酵條件下，米曲霉必須分泌大量的水解酶降解麩皮等原料中的糖類和蛋白質，以獲得生長所必須的營養物質。

大豆等制曲材料中的淀粉，只有先經制曲發酵，被米曲霉分泌的淀粉酶和糖化酶水解，才能在后期發酵中被酵母和細菌利用。由表1可知，蛋白點13、108和201是α-淀粉酶A，與米曲霉3.042相比，米曲霉ZJGS-LZ-12的蛋白點13和201分泌表達量上調3.24～5.05倍，而蛋白點108分泌表達量下調，說明不同α-淀粉酶A分泌表達量存在差異。LIANG Y C等[9]對紹興米酒曲中米曲霉SU16的胞外蛋白質組學研究發現，α-淀粉酶和它的水解產物占凝膠上可視蛋白點的70%以上；ODA K等[8]研究發現，利用蒸煮后的麥麩進行制曲，米曲霉RIB40分泌的α-淀粉酶和它的水解產物占凝膠上可視蛋白點的50%以上。這些研究結果表明，在制曲過程中，米曲霉都具有較強的分泌淀粉酶的能力。本研究中經PD Quest分析顯示，米曲霉ZJGS-LZ-12分泌的α-淀粉酶和它的水解產物占凝膠上可視點的60%以上，遠高于米曲霉3.042（40%），預示著米曲霉ZJGS-LZ-12在豆醬發酵中的優良性能。α-淀粉酶通過水解淀粉的α-1,4-糖苷鍵生成麥芽糖、葡萄糖等還原糖，可與醬醅中的氨基酸發生美拉德反應，形成豆醬色素，生成的酯類還可增加豆醬的香氣，與豆醬的色澤和香氣的形成有重要的關系[5，12]。另外，葡萄糖也是酵母菌和細菌生長所必須的碳源，酵母菌發酵葡萄糖產生乙醇，細菌發酵葡萄糖產生乳酸、醋酸及琥珀酸，這些醇類和有機酸是豆醬香氣的重要組成成分。

圖3 米曲霉胞外差異表達蛋白質的功能分類Fig.3 Functional classification for extracellular differential proteins expressed by Aspergillus oryzae

蛋白點73、187和124被鑒定為糖化酶。糖化酶又稱為葡萄糖淀粉酶，由基因glaA編碼，其能水解淀粉非還原性未端的α-1,4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖。米曲霉ZJGS-LZ-12的蛋白點73、187和124的分泌表達量下調0.10～0.36倍，說明米曲霉ZJGS-LZ-12分泌的糖化酶量比米曲霉3.042少。

蛋白點136、219、171和198被鑒定為纖維素酶，其中，蛋白點136為β-半乳糖苷酶A，米曲霉ZJGS-LZ-12分泌表達量上調1156倍，而另外3種分別為α/β葡萄糖苷酶agdC、β-1,4-D-葡聚纖維二糖水解酶A、β-1,4-內切葡聚糖酶B，分泌表達量均下調。其中，α/β-葡萄糖苷酶agdC具有α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶活性，參與細胞壁中纖維素的降解，生成D-葡萄糖。

蛋白點220、166、205、125、217、110、145、147和148被鑒定為半纖維素酶，其中米曲霉ZJGS-LZ-12的依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）（nicotinamide adenine dinucleotide（phosphate），NAD（P）H）D-木糖氧化還原酶xyl1和乙酰木聚糖酯酶A分泌表達量下調，其余分泌表達量均上調。在分泌表達量上調的蛋白中，β-1,4-外切木聚糖酶bxlB參與木聚糖的水解，水解β-1,4-D-木聚糖，從非還原末端依次切掉D-木糖殘基生成D-木糖，與豆醬香味及色澤形成有關。阿拉伯半乳聚糖-β-1,4-內切半乳聚糖酶A參與植物細胞壁多糖物質的降解，可水解I類阿拉伯半乳聚糖（arabogalactan，AGs），特異性作用于1,4-半乳糖苷鏈[17]。將AGs降解為低聚糖，供菌體生長利用。葡聚糖β-1,3-葡糖苷酶A參與β-葡聚糖的降解，從非還原末端切掉β-D-葡萄糖，釋放α-葡萄糖，生成的木糖、葡萄糖等產物與豆醬發酵過程中風味和色澤的形成有直接的關系。β-1,4-內切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶A參與木聚糖的降解，其中內切木聚糖酶水解木聚糖的主鏈生成低聚木糖及木糖；乙酰木聚糖酯酶A水解木聚糖上乙酰化的側鏈，提高內切木聚糖酶降解木聚糖的速度[18]。

在差異胞外蛋白質中，也有很多蛋白質被鑒定為降解酶，分別是亮氨酸氨基肽酶A（leucine aminopeptidase A，Lap A）（蛋白點126、168、215）、亮氨酸氨基肽酶A2（leucine aminopeptidase A2，Lap A2）（蛋白點41）、二肽水解酶5（蛋白點174）、中性蛋白酶2（neutral protease 2，Ntp 2）（蛋白點200）、堿性蛋白酶1（alkaline protease 1，Alp 1）（蛋白點114和194）及天冬氨酸肽酶（aspartyl aminopeptidase）（蛋白點222）和天冬氨酸蛋白酶（aspartic protease pep1，Pep1）（蛋白點106）。

亮氨酸氨基肽酶（Laps）屬于鋅需要型金屬蛋白酶類中的外肽酶，外肽酶在豆醬的工業生產中具有重要的作用，其能降解肽產生氨基酸，增加豆醬的鮮味[19]。米曲霉ZJGS-LZ-12的LapA（蛋白點215）分泌表達量上調2.33倍，而Lap2（蛋白點41）分泌表達量下調0.01倍。Lap2和LapA作用的最適pH值分別為9.5和8.5，偏堿性，在酸性條件下活性大大降低，而豆醬發酵的環境一般為4.6～5.0之間，屬于偏酸性環境，不利于Laps酶促反應的進行。

蛋白質先經過內肽酶降解為大分子肽，再經過Laps和二肽酰多肽酶IV（dipeptidyl-peptidase IV，DppIV）（X-脯氨酰基降解酶）的協同作用進一步降解為氨基酸。因為當X-脯氨酰基序列存在時，Laps降解肽的反應被終止，通過互補的方式，DppIV可以移除X-脯氨酰基序列，從而使Laps繼續水解氨基酸殘基[20]。

Ntp 2主要在中性pH條件下水解蛋白質分子。米曲霉是產工業蛋白酶的重要真菌之一，米曲霉3.042是我國最常用的生產豆醬的菌株，高產中性蛋白酶，而米曲霉ZJGS-LZ-12的Ntp2（蛋白點200）的分泌表達量下調。

Alp1是一種絲氨酸蛋白酶，米曲霉ZJGS-LZ-12的Alp1（蛋白點114）分泌表達量上調約1 300倍，降解蛋白質分子，生成小分子量的肽，促進原料蛋白質的利用。

天冬氨酸蛋白酶是一種分泌型內肽酶，屬于酸性蛋白酶，在米曲霉ZJGS-LZ-12中，其分泌表達量上調100多倍。研究表明，天冬氨酸蛋白酶可以在pH值3.5的條件下水解蛋白質（尤其是疏水性殘基）的肽鍵[20]，形成的各種多肽在肽酶作用下進一步被水解成游離氨基酸，大豆蛋白被水解生成的可溶性的?、胨、多肽及氨基酸，形成豆醬的營養物質氮素成分和鮮味。

3 結論

米曲霉ZJGS-LZ-12與我國傳統經典米曲霉3.042胞外蛋白的分泌能力相當，分別為（175.78±6.07）μg/g干曲和（183.52±23.07）μg/g干曲，但胞外分泌蛋白組存在顯著差異（P＜0.05）。雙向電泳結果表明，與米曲霉3.042相比，米曲霉ZJGS-LZ-12的差異表達蛋白點共169個，其中80個蛋白點分泌表達量下調，89個蛋白點分泌表達量上調。通過MALDI-TOF/TOF-MS法共鑒定出105個差異蛋白質點，通過和NCBI和Uniprot數據庫比對分析共發現27個差異蛋白質。通過差異蛋白質生物功能性分析，結果表明，差異蛋白質主要參與糖類和蛋白質水解過程，主要是水解淀粉、纖維素、半纖維素及蛋白質的酶。其中，淀粉水解酶、半纖維素酶活性顯著增強，β-1,4-內切木聚糖酶F3、β-半乳糖苷酶A和阿拉伯半乳聚糖-β-內切半乳聚糖酶A分泌表達量分別上調292、1 156和2 569倍；而蛋白酶Pep1和Alp1分泌表達量分別上調100和1 300倍。表明米曲霉ZJGS-LZ-12的分泌蛋白組具有較獨特的組成及活性，有利于降解大豆蛋白并提高原料利用率及豆醬的風味和營養。因此，米曲霉ZJGS-LZ-12是一株比較優良的工業菌株，適合用于豆醬的發酵生產。