微波輔助超聲法提取刺梨總皂苷的工藝研究

陳 帥，張興濤，姜茹心，陳春雪，趙桂芝，王慧竹

（1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林市毓文中學，吉林 吉林 132022）

刺梨（Rosa roxbunghii）又名山王果、茨梨、木梨子，屬薔薇科薔薇屬植物，主要分布于亞熱帶及暖溫帶地區，在我國主要分布于貴州、云南和四川等地，其中以貴州的野生與栽培資源最為豐富[1-3]。刺梨始載于《貴州通志》，性平，味苦、澀，歸胃、大腸經，具有消食健脾，收斂止瀉的功效，臨床用于治療積食腹脹，泄瀉等癥[3-4]。刺梨鮮果中含有18種氨基酸、維生素C、胡蘿卜素、B族等多種維生素，以及鈣、鐵、碘、鋅、硒等10多種微量元素。孫悅等[5]通過正交試驗優選了刺梨中維生素C的閃式提取工藝，結果顯示優化出的工藝條件簡單、經濟，提取率高。此外，刺梨中還含有多種活性成分，如黃酮、多酚、多糖、三萜類化合物等[3，6-7]。李志[8]采用正交試驗對刺梨中總黃酮的提取工藝進行了優化，結果顯示，在最優的工藝條件下刺梨總黃酮提取得率為0.57%；劉英等[9]在單因素試驗基礎上，通過中心組合試驗設計（central composite design，CCD），優化了刺梨中總黃酮的提取工藝，結果顯示總黃酮的提取率為10.76%；張匯慧等[10]通過中心組合試驗設計優化了刺梨黃酮的半仿生法提取工藝，在最佳工藝條件下總黃酮提取量為27.70 mg/g；李光等[11]通過響應面試驗優化了刺梨中多酚的提取工藝，結果顯示，在最佳工藝下多酚的平均提取含量為1.811 7%。孫紅艷等[12]通過正交試驗優化了超聲波法提取刺梨多酚的工藝，多酚提取率達15.930 mg/g。成剛等[13]通過正交試驗對微波輔助法提取刺梨多糖的工藝進行了優化，結果刺梨多糖的提取率達到16.036%，多糖含量為90.68%。代甜甜等[14]采用乙醇回流法提取得到刺梨總三萜，并對總三萜的含量測定方法進行了研究，結果顯示，在建立的含量測定方法下刺梨總三萜含量以熊果酸計為57.9%。目前鮮有有關刺梨總皂苷提取工藝研究的相關報道，為此，本研究利用響應面試驗對微波輔助超聲法提取刺梨中總皂苷的工藝進行了探索優化，以期為更好地開發和利用刺梨提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：采于貴州省畢節市七星關區，經吉林化工學院鐘方麗教授鑒定為薔薇科植物繅絲花（Rosa roxburghiiTratt.）的果實，自然陰干后備用；齊墩果酸（純度＞98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

TU-1950紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；XH-300UL電腦微波超聲波紫外光組合催化合成儀：北京祥鵠科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；RE-3000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；FA2204B電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；SK2510HP超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；DZF6050型真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總皂苷含量測定方法

對照品溶液制備：精密稱取齊墩果酸2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，繼續加甲醇稀釋至刻度，即得質量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液制備：準確稱取粉碎后的刺梨粉末（過60目篩）5.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，按既定的提取工藝進行刺梨總皂苷的提取，提取液進行減壓回收溶劑，80 ℃水浴蒸干殘留液，得浸膏，真空干燥，精密稱取干浸膏2.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度即得供試品溶液。

齊墩果酸標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0.5mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL分別置于5個10 mL具塞帶刻度試管中，在70 ℃水浴條件下揮干溶劑，然后分別加入6%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，高氯酸1.0 mL，于60 ℃水浴條件下振蕩反應20 min，取出，自然冷卻至室溫，以冰醋酸稀釋至刻度，在548 nm波長條件下測定吸光度值（A），以標準品質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為A=35.96C-0.002 1，相關系數R2=0.998 0。

供試品溶液中總皂苷含量測定：精密移取供試品溶液0.8 mL，按標準曲線制作步驟測得供試品溶液吸光度值，刺梨總皂苷得率計算公式如下：

式中：Y表示總皂苷得率，%；w表示每次提取刺梨總皂苷得到的干浸膏質量，g；Ai表示供試品溶液吸光度值。

1.3.2 刺梨總皂苷提取工藝優化單因素試驗

準確稱取刺梨粉末5份，每份5.0 g，分別按液料比（8∶1、10∶1、12∶1、15∶1、18∶1、20∶1（mL∶g））加入不同體積分數（20%、30%、40%、50%、60%、70%）的乙醇溶液，在微波功率（200 W、300 W、400 W、500 W、600 W、700 W），超聲頻率40 KHz，超聲功率1 200 W的條件下進行超聲輔助提取，超聲時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min），過濾，得提取液，制得供試品溶液，測定刺梨總皂苷得率，考察乙醇體積分數、液料比、微波功率及超聲時間對提取總皂苷的影響。

1.3.3 刺梨總皂苷提取工藝優化響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，根據CCD原理，選取乙醇體積分數（X1）、液料比（X2）、微波功率（X3）、超聲時間（X4）作為自變量，以刺梨總皂苷得率（Y）為因變量，設計響應面試驗[15-18]。試驗設計的因素及水平見表1。

表1 刺梨總皂苷提取工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction technology optimization of total saponins from Rosa roxburghii

1.3.4 數據處理

所有試驗數據均為重復3次試驗后的平均值，響應面試驗結果采用Minitab 16.2軟件進行分析處理，利用Origin 9.2進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對刺梨總皂苷得率的影響

從圖1中可以看出，當乙醇體積分數在20%～50%時，刺梨總皂苷的得率隨乙醇體積分數增大而迅速升高，當乙醇體積分數達到50%時，刺梨總皂苷得率最大，為3.8%，隨后隨著乙醇體積分數＞50%之后，刺梨總皂苷得率開始逐漸降低，可能是由于乙醇體積分數增加后，其他非皂苷成分溶出增多所致。因此，選擇乙醇體積分數40%、50%、60%進行響應面試驗。

2.1.2 液料比對總皂苷提取率的影響

圖2 液料比對刺梨總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on extraction rate of total saponins from Rosa roxburghii

從圖2可以看出，開始階段刺梨總皂苷得率隨液料比在8∶1～15∶1（mL∶g）范圍內的增大而逐漸上升，當液料比為15∶1（mL∶g）時，刺梨總皂苷得率最大，為3.83%，之后隨著液料比繼續增大，刺梨總皂苷得率開始下降，但液料比對刺梨總皂苷得率的總體影響不大。因此，液料比選擇12∶1、15∶1、18∶1（mL∶g）進行響應面試驗。

2.1.3 微波功率對刺梨總皂苷得率的影響

圖3 微波功率對刺梨總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction rate of total saponins from Rosa roxburghii

從圖3中可以看出，微波功率對刺梨總皂苷得率的影響比較顯著，當微波功率＜500 W之前，刺梨總皂苷的得率隨微波功率增加而迅速增大，當微波功率為500 W時，刺梨總皂苷得率最大，為3.81%，而后隨著微波功率的繼續增大，刺梨總皂苷得率開始下降，可能是由于微波功率增加后，其它非皂苷成分溶出增多所致，因此微波功率選擇400 W、500 W、600 W進行響應面試驗。

2.1.4 超聲時間對刺梨總皂苷得率的影響

圖4 超聲時間對刺梨總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total saponins from Rosa roxburghii

從圖4中可以看出，刺梨總皂苷得率隨超聲時間在5～20 min范圍內延長而逐漸增大，當超聲時間為20 min時，刺梨總皂苷得率最大，為3.93%，之后隨著超聲時間繼續延長，刺梨總皂苷得率開始下降，因此超聲輔助提取時間選擇15 min、20 min、25 min進行響應面試驗。

2.2 響應面試驗分析結果

2.2.1 響應面試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，根據CCD原理，選取乙醇體積分數（X1）、液料比（X2）、微波功率（X3）、超聲時間（X4）作為自變量，以刺梨總皂苷得率（Y）為因變量設計響應面試驗，響應面試驗設計及結果如表2所示。

表2 刺梨總皂苷提取工藝優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction technology optimization of total saponins from Rosa roxburghii

續表

利用Minitab 16.2軟件對表2中數據進行分析處理，得到以Y為因變量，X1、X2、X3、X4為自變量的四元二次方程：Y=-14.41+0.2X1+0.3X2+0.03X3+0.37X4+2.29E-003X1X2-2.5E-005X1X3+1.43E-003X1X4-9.17E-005X2X3+5.58E-003X2X4+4.25E-004X3X4-2.32E-003X12-0.017X22-2.90E-005X32-0.018X42，對此模型進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表3。

從表3中可以看出，回歸模型的P值為0.000 4，顯著性分析結果為極顯著（P＜0.01）；失擬項的P值為0.133 6＞0.05，說明模型的擬合程度良好，影響擬合的因素對試驗結果干擾很小；方程決定系數R為0.844 9，說明響應值的變化有84.49%來源于所選變量，由此反映出回歸模型的擬合程度良好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點進行分析和預測總皂苷得率。一次項X1、X3、X4、交互項X3X4、二次項X22對總皂苷得率影響顯著（P＜0.05），二次項X12、X32、X42對總皂苷得率影響極顯著（P＜0.01），而其他項影響則不顯著（P＞0.05），由此反映試驗選定的各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應曲面分析

為了更加清晰表達兩個因素對刺梨總皂苷得率的影響，在固定試驗選定的因素中任意兩個的值為零水平對應實際值的基礎上，考慮另外兩個因素對總皂苷得率的影響，根據回歸模型繪制響應曲面圖和等高線圖[19-22]，結果如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對總皂苷得率影響的響應曲面和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on total saponins yield

由圖5可知，響應曲面越陡峭，表明該因素對試驗結果的影響越顯著[12-15]，曲面頂點即為交互因素最佳取值的試驗結果，將響應曲面對底面做投影可得等高線圖，等高線圖的中心更加直觀地反映出最佳的提取工藝。從圖5中可以看出，微波功率、乙醇體積分數、超聲時間對總皂苷得率影響比較明顯，而微波功率和超聲時間二者的交互作用對試驗結果影響也比較顯著，這與表3的方差分析結果相吻合。

利用Minitab軟件可同時得到回歸模型優化的最佳提取工藝參數：乙醇體積分數為54.37%，液料比為14.8∶1（mL∶g），微波功率為545.05 W，超聲時間為21.66 min，考慮到實際情況，將上述工藝參數修正為：乙醇體積分數54%、液料比15∶1（mL∶g）、微波功率545 W、超聲時間22 min。在此最佳工藝條件下，重復3次平行驗證試驗，刺梨總皂苷得率為4.18%，實際平均得率與理論得率的差值僅占理論得率的0.7%，說明由模型方程優化的最佳工藝條件穩定可靠。

3 結論

采用微波輔助超聲法提取刺梨總皂苷的方法，以總皂苷得率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，利用響應面實驗設計優化了提取刺梨總皂苷的工藝條件，結果顯示，在乙醇體積分數54%、液料比15∶1（mL∶g）、微波功率545 W、超聲時間22 min的工藝條件下，刺梨總皂苷實際得率為4.18%，與理論預測值接近。反映了微波輔助超聲法可有效提取刺梨中總皂苷，為刺梨總皂苷在醫藥保健品領域的應用開發提供了參考。