牛肝菌多糖的提取及抗氧化性研究

鄧加聰，曾銹華，陳 婕，郭婷婷，王志輝，鄭 虹，2

（1.福建師范大學福清分校 海洋與生化工程學院，福建 福清 350300；2.近海流域環境測控治理福建省高校重點實驗室，福建 福清 350300；3.現代設施農業福建省高等學校工程研究中心，福建 福清 350300）

牛肝菌（Boletus）是一種藥、食兼用的野生珍稀食用菌。它富含多糖、多酚、多種維生素、氨基酸、蛋白質等人體需要的營養物質，具有降血脂、抗腫瘤、改善免疫系統、抗氧化等功效[1-5]。

當前牛肝菌為我國菌類產品出口創匯作出了重要貢獻，并且牛肝菌作為一種未被完全開發的高營養的美味食用菌類，對其藥用及營養價值的研究將對更深一步開發牛肝菌資源有著十分重要的理論意義。近年來，牛肝菌的研究主要集中在其的營養成分含量[6-8]、多糖的提取工藝[9-10]及抗氧化作用[11]。常用的提取多糖方法有熱水浸提法、微波提取法、泡沫分離法等[12-14]。目前報道較多的是熱水浸提法，微波提取牛肝菌多糖的相關研究鮮見報道。

本試驗通過單因素和正交試驗優化云南牛肝菌多糖提取工藝，并利用1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和羥基自由基（·OH）清除能力測定法對其抗氧化性進行了測定[15-16]。以期為牛肝菌食物資源的開發和綜合利用提供參考依據。

1 材料與試劑

1.1 材料與試劑

牛肝菌粉末：云南；無水氯化鈣、乙醇、葡萄糖、苯酚（重蒸餾）、硫酸、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、DPPH（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-250E超聲波清洗器：昆山市超聲儀有限公司；TDL-4低速離心機：福州精儀儀器有限公司；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥機：上海躍進醫療器械有限公司；T22SP分光光度計：上海棱光儀器有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛肝菌粗多糖的提取方法

稱取一定量牛肝菌子實體粉末，以水為提取液，按一定的料液比，在一定溫度條件下超聲一定時間后，4 000 r/min離心10 min，收集上清液；上清液用氯化鈣法去除蛋白[17-18]，4 000 r/min離心10 min，收集上清液；上清液進行旋轉蒸發濃縮至原來體積的1/3，加入4倍體積體積分數95%的乙醇過夜沉淀；4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，沉淀于60 ℃干燥得牛肝菌粗多糖。

1.3.2 牛肝菌粗多糖提取工藝優化單因素試驗

料液比對牛肝菌粗多糖提取的影響：稱取2 g牛肝菌粉末，控制超聲時間為1 h、超聲溫度為60 ℃、超聲波功率為400 W，分別在不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））條件下進行超聲波浸提試驗，考察牛肝菌多糖在不同料液比條件的提取效果。

超聲時間對牛肝菌粗多糖提取的影響：稱取牛肝菌粉末2 g，料液比為1∶20（g∶mL），在超聲溫度為60 ℃、超聲功率為400 W的條件下，超聲不同時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h），考察牛肝菌多糖在不同超聲時間下的提取效果。

超聲溫度對牛肝菌粗多糖提取的影響：稱取牛肝菌粉末2 g，料液比為1∶20（g∶mL），超聲時間為0.5 h，超聲功率為400 W的條件下，在不同超聲溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）條件下進行超聲，考察牛肝菌多糖在不同超聲溫度條件下的提取效果。

1.3.3 牛肝菌粗多糖提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取料液比、超聲時間和超聲溫度3個因素，每個因素3個水平進行L9（33）正交試驗，優化超聲浸提過程的工藝條件。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 牛肝菌粗多糖提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for crude polysaccharide extraction conditions optimization from Boletus

1.3.4 測定方法

牛肝菌多糖含量：采用苯酚-硫酸法[19-20]進行測定。多糖得率計算公式如下：

1.3.5 牛肝菌粗多糖抗氧化性的測定

（1）DPPH自由基（DPPH·）清除能力：參照參考文獻[21-22]的方法進行測定。

總之，口語交際活動都發生在一定的語境中。在教學中，我們要利用一切可以利用的資源，創設與教學內容相關的語境，這樣更容易激發學生內在的動力，提高學習效果。但也有一點是值得注意的，語境的創設應盡量避免人為創設帶來的造作的不真實感，真正達到較好的教學效果。

取不同質量濃度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL）的牛肝菌多糖溶液2 mL；添加2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L），振蕩搖勻后，暗處、室溫條件下靜置30 min，在波長517 nm處測其吸光度值（A1），同時以2 mL不同濃度的多糖與2 mL無水乙醇混勻后，在波長517 nm處測得吸光度值（A2）；以無水乙醇為空白，測得吸光度值（A0）；以不同質量濃度（0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL）的抗壞血酸（vitamin C，VC）水溶液為對照。每個樣品溶液進行3個平行。清除率按公式（1）計算。

（2）·OH清除率：參照參考文獻[23-24]的方法進行測定。

取不同質量濃度（2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10 mg/mL）的牛肝菌多糖溶液1 mL于試管中，加入1 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L）和1 mL水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），再加入1 mL的H2O2溶液（8.8 mmol/L），37 ℃水浴中反應30 min后，6 000 r/min離心10 min，在波長510 nm處測定吸光度值（A1），同時以蒸餾水代替H2O2溶液，其他條件不變，測定吸光度值（A2）；以不加多糖的蒸餾水為空白組，測定吸光度值（A0）；以不同質量濃度（0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL）的抗壞血酸（VC）水溶液為對照。每個樣品溶液進行3個平行。清除率按公式（2）計算。

2 結果與分析

2.1 牛肝菌粗多糖提取工藝單因素試驗結果

2.1.1 料液比對牛肝菌多糖提取效果的影響

圖1 料液比對牛肝菌多糖得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on polysaccharide yield from Boletus

由圖1可見，牛肝菌多糖得率隨著料液比中用水量的增大而逐漸增加，當料液比為1∶20（g∶mL）時，多糖得率最高，為21%；而料液比為1∶25～1∶35（g∶mL）時，多糖得率反而有所降低，說明適宜的料液比有利于多糖的浸出，料液比過低，多糖浸出不完全，導致多糖得率較低，料液比過高，不利于后期的蒸餾濃縮。因此，選擇最適料液比為1∶20（g∶mL）。

2.1.2 超聲時間對牛肝菌多糖提取效果的影響

圖2 超聲時間對牛肝菌多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield from Boletus

由圖2可見，牛肝菌多糖得率隨著超聲時間的延長呈先增后降的趨勢。在超聲時間為0.5～2.0 h時，隨著超聲時間的延長，多糖得率逐漸增大；當超聲時間為2.0 h時，多糖得率達到最大值，為19.76%；之后，牛肝菌多糖得率隨著超聲時間的延長逐漸降低。這可能是由于超聲波的機械剪切作用過度，導致部分多糖被降解，從而使多糖得率下降[11]。因此，選擇最適超聲時間為2.0 h。

2.1.3 超聲溫度對牛肝菌多糖提取效果的影響

圖3 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield from Boletus

2.2 牛肝菌多糖提取的正交設計試驗

表2 牛肝菌粗多糖提取條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction conditions optimization of polysaccharide from Boletus

由表2可知，牛肝菌粗多糖得率受各因素影響的次序為A＞B＞C，即料液比對粗多糖得率的影響最大，超聲溫度次之，超聲時間最小。最佳工藝組合為A1B2C2，即料液比為1∶15（g∶mL），超聲時間為2 h，超聲溫度為60 ℃，在此條件下，牛肝菌的多糖得率為41.76%。

2.3 牛肝菌粗多糖對DPPH·和·OH的清除作用

圖4 牛肝菌粗多糖對DPPH·（a）和·OH（b）的清除效果Fig.4 Scavenging effect of crude polysaccharides of Boletus on DPPH·(a) and·OH (b)

由圖4（a）可見，VC和牛肝菌多糖的濃度對DPPH·清除率具有顯著影響。當VC質量濃度為0.2 mg/mL時，其DPPH·清除率已達100%；與VC相比，牛肝菌多糖質量濃度為0.752 mg/mL時，DPPH·清除率為50%；當多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，多糖對DPPH·的清除率可達71.19%。多糖對DPPH·的半抑制濃度（half maximal inhibition concentration，IC50）為0.75mg/mL。

由圖4（b）可見，VC對·OH具有很強的清除能力。當VC質量濃度為2.0 mg/mL時，清除效果已經達到100%。與VC相比，牛肝菌多糖對·OH清除作用較差。當牛肝菌多糖質量濃度為5.12 mg/mL時，多糖對·OH的清除率為50%；當多糖質量濃度為10 mg/mL時，多糖對·OH的清除率可達80.69%。多糖對·OH的IC50值為5.12mg/mL。

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗，獲得超聲波浸提牛肝菌多糖的最佳工藝組合為A1B2C2，即料液比為1∶15（g∶mL），超聲時間為2 h，超聲溫度為60 ℃，在此條件下，牛肝菌的多糖得率為41.76%。與VC相比，多糖對DPPH·和·OH的清除能力存在一定的差異，多糖對DPPH·和·OH的IC50值分別為0.75mg/mL和5.12mg/mL，當多糖質量濃度分別為1.00 mg/mL和10.00 mg/mL時，多糖對DPPH·和·OH的清除率分別為71.19%和80.69%。