內鏡黏膜下剝離術在結直腸側向發育型腫瘤患者中的 治療效果及對Wnt和整合素信號通路的影響*

陳健，張肖麗，張月曉，李萍，齊月雯，付欣姿，劉璐，李炳慶

（承德醫學院附屬醫院 消化內科，河北 承德 067000）

結直腸側向發育型腫瘤（latelly spreading tumor，LST）是在患者機體內生長、腫瘤直徑超過1.0 cm 的病變，其與普通腫瘤的區別在于病灶腫瘤生長方式的不同。普通腫瘤病灶的生長方式為垂直生長，而結直腸LST 的生長方式是通過側面擴大發展，屬于扁平型結直腸腫瘤病變疾病，會嚴重影響患者的生活質量水平和生存質量[1]。隨著醫學技術的不斷進步，染色劑放大內鏡技術已得到了普遍的運用，不僅可以提高結直腸LST 臨床的診斷率，還可以通過手術治療改善患者的病情，具有重要的應用價值[2]。傳統的內鏡切除術可以達到一定的臨床效果，其不適用于病灶超過2 cm 的患者，所以切除病灶的完整率較低，會影響患者的治療效果。內鏡黏膜下剝離術（endoscopic submucosal dissection，ESD）則可以有效解決切除不完整的問題，且可以影響Wnt 及整合素信號通路，有助于抑制腫瘤的進一步發展和轉移[3]。本研究對ESD在結直腸LST 患者中的治療效果及對Wnt 及整合素信號通路的影響進行了研究，旨在證實ESD 良好的臨床效果。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月-2018年6月本院收治的70例結直腸LST 患者，隨機分為兩組，每組患者35例。納入標準：①通過結腸鏡檢出病變直徑2.0 cm 以上；②患者自愿參與本次研究。排除標準：①抬舉征為陰性的患者；②放大內鏡觀察結直腸黏膜Pit Pattern分型為不規則形態；③患者不同意參與本次研究。研究組中，男20例，女15例，年齡38～66 歲，平均（45.3±1.3）歲；對照組中，男22例，女13例，年齡37～65 歲，平均（44.6±1.5）歲。兩組患者的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會批準且患者均知情同意。

1.2 方法

手術前對所有患者進行心電圖、血常規、凝血功能、生化、心臟超聲和胸片等常規術前檢查，必要時給予糾正，給予患者丁溴東莨菪堿緩解腸道痙攣，全憑靜脈麻醉下手術。

1.2.1 研究組 對研究組患者進行ESD 治療。給予靛胭脂染色后，確定病變區域的環境來確定患者的病變情況。取靛胭脂腎上腺素氯化鈉注射液，注射在患者病變的基底以及病變周圍的黏膜區，必要時注射液中按比例加入玻璃酸鈉注射液。在病變位置的外側大約0.5 cm 處用Dual 刀切開環形黏膜，接著進行剝離操作，一直到整個病變區域黏膜完全剝離為止。在進行黏膜剝離時要注意患者術中出血的風險，提前準備好電凝鉗進行止血[4]。手術后對創面運用電凝鉗進行徹底止血，有需要時運用鈦夾行止血或封閉創面，將剝離完成后的標本完全展開，使用昆蟲針將其固定在標本板上，浸泡在甲醛溶液中送到病理科進行組織病理檢查[5-6]。手術結束后，醫師要叮囑患者在術后禁止飲食至少48 h，同時給予患者補液，必要時給予抗生素預防感染等處理，依據患者術后的腹痛和便血等情況來判斷患者的恢復狀況，要定期進行隨訪記錄[7]。

1.2.2 對照組 對照組患者采用分片切除術，在內鏡下用靛胭脂染色確定病變范圍；于病變基底黏膜下注射，使病變充分隆起，在透明帽輔助下，將病灶吸入透明帽，并行內鏡下圈套電切、電凝，按照病灶大小分次切除，方法為沿著病灶一側多次切除，直至患者病灶被完全切除[8]。切除后，染色檢查患者創面邊緣有無病灶遺留，若有殘留病灶可予氬氣刀治療，觀察患者創面有無出血、是否平整等。

1.3 觀察標準

1.3.1 免疫功能觀察標準 在治療前后抽取患者外周血淋巴細胞，采用機型為EPICSXL 的流式細胞儀對CD4+和CD8+進行測定，并計算CD4+/CD8+的數值。

1.3.2 不良反應評定標準 通過隨訪，記錄患者在術后產生的不良反應，不良反應主要有穿孔、消化道出血和復發等。

1.3.3 生命質量評分標準 生命質量評分（quality of life，QOL）標準：觀察患者治療前后食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦和疼痛等方面的情況，食欲、精神、睡眠、疲倦和疼痛的滿分值為5 分，生活能力方面的滿分值為20 分，每一項的分數越高則證明生活質量越差[9]。

1.4 Wnt/β-catenin 通路分子表達量測定

應用Western blotting 方法對Wnt 通路進行分析。對Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標應用熒光定量PCR 試劑盒進行測定，數值越接近正常值，治療效果越好。Western 印跡分析檢測，對培養細胞進行收集，用PBS 清洗，加入細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，應用Bradford 比色法測定蛋白含量。每個樣品槽內45μl 樣本進行SDS-PAGE 電泳，通過電轉印法，將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉移至PVDF 膜，轉印后的PVDF 膜用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，再加入一抗（濃度1 ∶1 000），37℃孵育2 h，TBS 洗膜后加入濃度為1 ∶5 000 的二抗（羊抗兔），37℃孵育2 h，TBS 洗膜，DAB 顯色液顯色，拍照。熒光定量PCR 檢測，首先進行組織培養，然后對培養細胞進行收集、染色，抽提總RNA，反轉錄制備cDNA，按照說明書步驟操作。

1.5 統計學方法

數據應用SPSS 18.0 統計軟件進行分析，其中計數以百分比（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，行t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者免疫功能比較

術前兩組患者的免疫功能比較，差異無統計學意義（P＞0.05），術后研究組患者的免疫功能指標明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者手術前后免疫功能比較 （±s）Table1 Comparison of immune function before and after surgery between the two groups （±s）

表1 兩組患者手術前后免疫功能比較 （±s）Table1 Comparison of immune function before and after surgery between the two groups （±s）

注：t 組間值和P 組間值為研究組與對照組治療后比較

組別 CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對照組（n =35） 術前 42.3±1.6 14.4±1.2 2.1±0.4 術后 46.5±1.4 18.3±1.3 2.3±0.6 t 值 10.48 12.10 11.94 P 值 0.042 0.046 0.049研究組（n =35） 術前 42.7±1.3 14.7±1.5 2.1±0.5 術后 52.5±1.7 20.5±1.0 2.7±0.8 t 值 12.84 15.01 15.22 P 值 0.039 0.031 0.034 t 組間值 16.84 18.25 18.01 t 組間值 0.011 0.016 0.013

2.2 兩組患者術后不良反應比較

兩組患者在術后均未出現嚴重并發癥，如穿孔、消化道出血等。

2.3 兩組患者術后復發情況比較

對照組復發3例，復發率為8.6%，研究組復發1例，復發率為2.9%，研究組復發率低于對照組，但兩組比較，差異無統計學意義（χ2=5.88，P=0.082）。

2.4 兩組患者生活質量水平比較

術前兩組患者的生活質量水平差異無統計學意義（P＞0.05），術后研究組與對照組患者QOL 評分均明顯低于術前，差異具有統計學意義（P＜0.05），且術后研究組患者QOL 評分明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.5 兩組患者病變部位比較

對照組患者的病變有37 處。其中，橫結腸4 處，直腸10 處，乙狀結腸15 處，降結腸3 處，升結腸5 處。研究組患者的病變有38 處。其中，橫結腸3 處，直腸6 處，乙狀結腸22 處，降結腸5 處，升結腸2 處，兩組患者病變部位比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 兩組患者QOL 評分情況比較 （分，±s）Table2 Comparison of QOL score between the two groups （score，±s）

表2 兩組患者QOL 評分情況比較 （分，±s）Table2 Comparison of QOL score between the two groups （score，±s）

注：t 組間值和P 組間值為研究組與對照組治療后比較

組別 食欲 精神 睡眠 生活能力 疲倦 疼痛對照組（n =35） 術前 3.1±1.3 4.1±1.4 3.6±1.2 18.2±3.1 3.2±1.1 5.1±1.5 術后 2.3±0.5 3.2±1.2 3.5±1.6 15.2±3.4 2.2±1.5 4.6±1.4 t 值 10.41 11.02 11.84 12.05 12.84 12.65 P 值 0.022 0.026 0.049 0.013 0.021 0.042研究組（n =35） 術前 3.1±1.2 4.1±1.3 3.5±1.8 17.9±4.1 3.2±1.3 5.2±1.3 術后 1.4±0.7 2.3±0.8 2.1±1.1 12.4±4.8 1.5±0.9 3.2±1.2 t 值 15.00 15.61 16.84 15.48 16.02 15.43 P 值 0.033 0.028 0.022 0.041 0.026 0.049 t 組間值 18.94 19.02 18.41 19.42 18.40 19.84 P 組間值 0.032 0.023 0.019 0.041 0.036 0.021

2.6 兩組患者大體分型比較

如表4所示，對照組大體分型為顆粒均一型16處，結節混合型11 處，扁平隆起型8 處，假凹陷型2 處；研究組大體分型為顆粒均一型15 處，結節混合型11處，扁平隆起型7 處，假凹陷型5 處，兩組患者大體分型比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 兩組患者病變部位比較例（%）Table3 Comparison of lesion position between the two groups n（%）

表4 兩組患者大體分型比較例（%）Table4 Comparison of gross classification between the two groups n（%）

2.7 兩組患者病變直徑比較

兩組患者的病變直徑比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

2.8 治療前后兩組患者Wnt/β-catenin 通路分子表達量比較

治療前，兩組Wnt/β-catenin 通路分子表達量沒有明顯區別（P＞0.05）；治療后，研究組Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表5 兩組患者病變直徑比較 （mm，±s）Table5 Comparison of lesion diameter between the two groups （mm，±s）

表5 兩組患者病變直徑比較 （mm，±s）Table5 Comparison of lesion diameter between the two groups （mm，±s）

組別 最大直徑 最小直徑 平均直徑對照組（n =35） 40.1±4.0 11.4±2.2 25.8±2.4研究組（n =35） 40.1±4.4 11.3±2.3 26.2±2.6 t 值 1.58 1.85 1.62 P 值 0.091 0.084 0.082

表6 治療前后兩組患者Wnt/β-catenin 通路分子表達量比較Table6 Comparison of molecular expression of Wnt/β-catenin pathway between the two groups before and after treatment

3 討論

結直腸LST 相比普通腫瘤中結直腸黏膜誘發的隆起性病變，其特異性和特殊性更強，且隨著病情的逐漸發展，患者病變的形態會出現顯著差別，臨床稱此特殊病變為大腸腺瘤，屬于特殊腫瘤類型疾病之一[10-11]。據臨床相關研究[12]報道，結直腸LST的外表相對較平坦，采用傳統的內鏡下黏膜切除術（endoscopic mucosal resection，EMR）無法完全切除，但是患者病變直徑如果超過2.0 cm，采用分片切除術進行治療時，患者常會伴有復發或者腫瘤殘余的情況，不利于患者的生活質量及病情的康復。本次研究運用ESD 對結直腸LST 患者進行治療，分析其臨床療效及其對Wnt 和整合素信號通路的影響。

采用ESD 對結直腸LST 患者進行治療，可以有效減少手術創傷，減輕對機體造成的免疫抑制程度。本研究顯示，術前兩組患者的免疫功能比較，差異無統計學意義（P＞0.05），術后研究組患者的免疫功能指標明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。這一結果說明，采用ESD 治療可以有效降低患者術后免疫抑制程度，這也是促進患者康復的關鍵。結直腸LST 存在易癌變和不容易向黏膜下浸潤等特點，其中假凹陷型病變發生黏膜癌變的可能性最大，且在大腸癌的發生中意義重大，備受臨床內鏡醫師的關注[13]。ESD 是近年發展起來的新型內鏡治療技術，其可以一次性地將整個病變區域切除，可以有效避免采用分片切除術引起的病灶殘留，且采用ESD 還能提供完整的病理組織資料，可以準確評估病灶的邊緣情況，有助于降低病變的復發率，是目前臨床上治療結直腸LST 最理想的方法[14-15]。兩組患者在術后均未出現嚴重并發癥，如穿孔和消化道出血，研究組患者術后復發率為2.9%，對照組患者術后復發率為8.6%，研究組復發率與對照組無明顯差異（P＞0.05）。雖然，本研究中并未出現穿孔病例，但是以往有研究[16]表明，ESD 具有較高的穿孔發生率，分析其原因可能與腫瘤大小、手術時間及醫師操作水平等有關。結直腸LST 的癌變率較高，組織中存在較多與腫瘤發生、發展及轉移相關的基因，Wnt 是一種分泌型蛋白，其通過自身分泌和其他細胞分泌來與細胞膜上的受體進行結合，可以將多條細胞的信號通道激活。Wnt 信號通路可以參與到多種細胞的增殖和分化，其通路具有高度的保守性，并且Wnt信號通路在成熟組織中及胚胎生長中發揮著重要的 作用[17-18]。

Wnt/β-catenin 通路在結直腸LST 患者病程中具有非常重要作用，是一種有效信號通路，該家族中包括19 個成員，在病情發展變化中，Wnt1、Wnt5a 和Wnt7b 等均會參與，對病情發展變化產生嚴重影響。β-catenin 為Wnt 通路中非常重要的樞紐分子，如果Wnt 刺激較少，會與GSK-3β、Axin 和APC 形成復合體，降低了造成細胞質游離的β-catenin，抑制信號通路。另外，當細胞內進入Wnt1、Wnt5a 和Wnt7b 等分子后，β-catenin 與GSK-3β、Axin 和APC 會出現進一步解離，在子細胞質中不斷增多，再在細胞核中轉位，對下游靶基因表達進行進一步轉位。本研究探究ESD 在結直腸LST 患者中對Wnt 信號通路的影響，研究結果顯示，治療前，兩組Wnt/β-catenin 通路分子表達量沒有明顯區別（P＞0.05）；治療后，研究組Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標低于對照組（P＜0.05），兩組患者與治療前比較，Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標均得到明顯改善。本研究表明，對結直腸LST 患者進行ESD 治療，效果理想，可對Wnt/β-catenin 通路的激活進行有效抑制，對治療效果提升具有非常重要的作用。

使用ESD 對結直腸LST 患者進行治療，在此過程中會抑制Wnt 信號通路的表達，會迅速抑制Wnt 與其他受體復合物結合，使Wnt 的靶基因得不到表達，并且無法進入細胞核內達到“啟動狀態”，而Wnt 蛋白富含半胱氨酸類的糖蛋白，留存于半胱氨酸的恒定保守區[19]。當Wnt 沒有信號時，無法刺激腫瘤細胞進一步發展，采用ESD 有助于整合素信號通路[20]。Wnt 信號通路中的β-catenin 以及下游信號通路在直腸癌患者中的表達上升，其作用機制還不明確。患者GSK-3β 的磷酸化是誘發β-catenin 上升的影響因素。磷酸化GSK-3β 屬于GSK-3β 的重要失活形式，磷酸化GSK-3β 表達上升之后，失活GSK-3β增多，降解胞質當中β-catenin 的效果也隨之下降，使得β-catenin 表達上升。整合素鏈接激酶（integrin linked kinase，ILK）是β-catenin 的上游調節分子，能夠磷酸化GSK-3β，增加β-catenin 表達，在ILK表達上升之后，ILK 可以趁機使GSK-3β 的磷酸化，使得GSK-3β 喪失活性而使β-catenin 表達上升，激活下游通路[20]。ESD 術后，ILK 能夠借助于磷酸化GSK-3β 來刺激β-catenin 表達上調。

本研究不足之處，因結直腸LST 發病率較低，本次研究的樣本數量較少，持續時間較短，缺乏客觀性。因此，需要進一步進行多中心、大樣本的研究來提高研究的可靠性。

綜上所述，ESD 在結直腸LST 患者的治療中具有良好的臨床療效，可提高患者術后的生活質量水平和免疫功能，且可以有效抑制Wnt 基因的表達，阻斷Wnt 在腫瘤中的發生、發展及轉移，具有廣泛的應用前景，值得在臨床上進一步推廣和應用。