I型膠原與異丙腎上腺素調控三維培養膠上大鼠氣道平滑肌細胞的分枝結構形成*

錢智莉，鄧林紅，歐陽明星

(常州大學生物醫學工程與健康科學研究院，常州 213164 )

1 引 言

細胞群體形態學是個體發育和組織生物工程領域的重要研究方向。近些年的研究顯示，I型膠原(Type I Collagen)在形態發生學上具有獨特的功能，例如介導細胞間的長距離相互作用，通過生成的膠原纖維帶誘導上皮管狀結構的形態發生[1-2]，或為腫瘤細胞的定向遷移提供通路[3]。

氣道平滑肌為呼吸系統的氣道提供了結構支撐和收縮功能[4-5]，而平滑肌層的增厚和力學性能改變也成為慢性哮喘的病理機理研究中，導致氣道高反應性現象(airway hyper-responsiveness, AHR)的關鍵方向[6-7]。臨床上，異丙腎上腺素(ISO)作為一種哮喘氣道高反應性的舒張藥物，作用于支氣管平滑肌β2受體，產生較強的舒張作用，解除支氣管痙攣[8]。考慮平滑肌細胞的力學性能在實現呼吸功能和在哮喘氣道高反應性中的重要性，以及聯系我們此前的研究發現，即I型膠原介導細胞長程力作用誘導上皮管狀結構的形態發生[1]，本研究初步探索了在含有I型膠原的三維matrigel上，大鼠氣道平滑肌細胞的形態發生。

在體內，I型膠原常以長纖維束的形態廣泛存在于多種組織中[9]；體外分離的I型膠原也能重新形成水凝膠狀，或組裝成纖維絲[10]?；|膜(basement membrane, BM)是常見于上皮層、內皮層、間皮層等組織中一種層狀結構的細胞外基質，其主要結構成分包含IV型膠原(Collagen IV)、層粘連蛋白、巢蛋白、基底膜蛋白多糖等[11]。從富含胞外基質蛋白的小鼠腫瘤中分離出的Matrigel，成分和基質膜相似，常用作基質膜的代替產品。實驗操作中，Matrigel在4℃下是溶液狀態，轉移到37℃后變成凝膠態，這個過程也是可逆的，因此常用于三維水凝膠的制作[12]。

本研究發現，大鼠氣道平滑肌細胞培養在含I型膠原的三維matrigel上，12～16 h內自動生成多個的分枝形態結構，而在不含I型膠原的三維matrigel上，或包被有I型膠原的玻璃皿上，細胞都不會出現分枝形態結構，顯示I型膠原和該三維水凝膠環境都是必要因素。用氣道平滑肌舒張劑異丙腎上腺素處理后，分枝形態結構的發生也極大地被抑制，提示依賴于I型膠原的該分枝形態發生需要生物力學因素的參與。

2 材料和方法

2.1 實驗材料

雌性Sprague Dawley大鼠(簡稱SD大鼠)，常州卡文斯動物實驗有限公司；培養瓶、共聚焦皿，美國corning公司(Corning,NY)。

2.2 實驗主要儀器設備

CO2細胞培養箱，日本三洋公司；生物安全柜(BSC-1300ⅡA2)，蘇州安泰空氣技術有限公司；超級純水儀(Milli Q Plus,Integral 10)，美國Millipore公司；高速臺式冷凍離心機(Coulter Allegra X-30R)，美國Beckman公司；倒置顯微鏡(Primo Vert)、倒置熒光顯微鏡(cell observer)、激光共聚焦顯微鏡(LSM710)，德國Zeiss公司；酶聯免疫分析儀(Infinite F50)，瑞士TECAN公司；體視顯微鏡(S8APO)，德國Leica公司。

2.3 試劑

鹽酸異丙腎上腺素，上海源葉生物科技有限公司；鼠尾I型膠原，R&D System；Matrigel，美國BD Bioscience公司；杜氏改良培養基(dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶，美國Gibco公司; 噻唑藍(methylthiazolydiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)，美國Sigma公司;戊巴比妥鈉，德國Merck公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，上海凌風化學試劑有限公司；其他化學試劑均為分析純。

2.4 大鼠ASM細胞原代培養

本研究采用參考文獻[13]的原代平滑肌細胞提取方法對SD大鼠ASM細胞進行體外分離和原代培養。首先注射戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)于SD大鼠腹腔進行麻醉，在潔凈臺內打開胸腔取出氣道，遂立即放入盛有適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)(pH7.4)的培養皿中。然后在體視顯微鏡下用鑷子輕輕剝離氣道黏膜層，將氣道組織在PBS溶液中剪成約1 mm ×1 mm×1 mm的碎塊，用PBS離心棄上清又重懸3次后，加入胰蛋白酶(0.1%)至沒過組織塊，將其置于CO2培養箱內消化15 min，隨后添加含20% FBS的培養基終止消化。預冷離心機至4℃，將組織塊重懸后1 600 r/min離心4 min,棄去上清，加入含80% DMEM、20% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的完全培養基，重懸組織塊并將組織塊均勻分布于培養瓶內。最后，培養箱中培養6 h后，將培養瓶輕輕翻轉后加入1mL完全培養基，靜置培養約2～3 d后有細胞爬出。大約10 d后，細胞會呈現“峰-谷”狀。采用免疫熒光染色技術標記α-SMA，鑒定差時貼壁法純化后的細胞為大鼠ASM細胞，取4～10代的細胞進行實驗。

2.5 三維基底膠的制作

本次對細胞行為的研究均在三維基底膠上實現。具體操作方法為：先將PDMS與交聯劑以10：1比例混合，充分攪拌至各項均勻后，加入皿里自然鋪開，制成一張厚度約為600 μm的PDMS膜，然后用模具壓出內徑為1 cm的正方形或0.6 cm的圓環，滅菌后，利用PDMS表面的疏水性緊密貼合于共聚焦皿底部的玻璃表面，使共聚焦皿底部出現一個PDMS圓環。將裝有PDMS圓環的共聚焦皿置于冰上預冷，在冰上將預冷的CollagenI(COL I)加入Matrigel中配置成含有0.5 mg/mL COL I的Matrigel溶液，加入30 μL溶液使其填平PDMS圓環的內部，放入37℃培養箱30 min成膠后即可在上面接種細胞。

2.6 MTT比色法檢測細胞活性

取2.4節培養的對數生長期的大鼠ASM細胞，以1×104個/孔的密度接種于 96 孔細胞培養板中，培養 24 h 后換成無血清培養基 (DMEM中加人5 mg/L胰島素、5 mg/L轉鐵蛋白、100 U/mL青霉素和 100 pg/mL 鏈霉素 ) ， 12 h 后培養皿分別加入終濃度為 0、10、20、40、80、160、320、640 μm/L鹽酸異丙腎上腺素,每個組10個復孔。將加藥后的96孔板置于培養箱培養24 h后,每孔加入MTT(5 mg/mL)各20 μL，孵育 4 h 后，輕輕吸去液體，每孔加入200 μL的DMSO,將96孔細胞培養板放置于搖床上振蕩10 min后，用酶聯免疫分析儀測定波長為495nm下的光密度值,進而篩選ISO作用的安全濃度,以排除ISO的可能細胞毒性對實驗結果的影響。

3 結果

3.1 三維培養膠上大鼠氣道平滑肌細胞的分枝結構發生

根據我們以前的研究累積[1]，以及考慮氣道平滑肌細胞力學性能的生理重要性，本研究在含有0.5 mg/mL I型膠原的三維matrigel膠上先初步研究大鼠氣道平滑肌細胞的群體行為。我們在實驗室加工了內徑為1 cm ×1 cm，高度約0.6 mm，底部為共聚焦皿玻璃底的方形槽，然后在槽中把膠做好，把細胞(2.0×104個細胞/m2)培養在膠上。12～16 h后，細胞已快速形成了許多分枝的形態結構，見圖1(a)。相對照，把細胞培養在包被有I型膠原，matrigel或matrigel+I型膠原混合溶液的共聚焦皿平面上，雖然生長良好，但不會形成分枝結構，而是以獨立的單個細胞形態存在，見圖1(b)。這揭示在細胞群體水平上，分枝結構的形態發生依賴底部的三維膠環境。

圖1三維培養膠上大鼠氣道平滑肌細胞的分枝結構發生(a).約2.0×104個ASM細胞種植在1cm×1cm的方形三維matrigel上(含有0.5mg/mL COL I)，培養16h后細胞分枝形態的形成；(b).ASM細胞種植在表面包被有COL I，matrigel，或matrigel+COL I的共聚焦玻璃皿上，培養約16h后的形態

Fig.1The branching morphogenesis of ASM cells cultured on3D matrigel with COL I(a).The branching morphology of2.0×104ASM cells after cultured for16h on1cm×1cm square size of3D matrigel with0.5mg/ml COL I；(b).The morphology of ASM cells after16h culture on glass-bottom dishes coated with matrigel, COL I, or mixture of both

3.2 I型膠原調控三維膠上細胞分枝結構的形態發生

我們檢測了I型膠原在細胞分枝形態發生中的必要性。在不含I型膠原的三維matrigel上，培養的大鼠氣道平滑肌細胞僅形成一個一個的細胞團形態；相比較，當存在I型膠原時，三維膠上的細胞分散相連形成分枝形態結構，見圖2(a)，因此，I型膠原成分和三維膠都是必要的。

為了初步分析這種分枝形態發生是否與平滑肌細胞本身的特性有相關性，我們也觀察了來自人源的氣道上皮細胞(HBEC)在相似培養條件下的形態發生。在體內，氣道上皮和氣道平滑肌之間有間質細胞和胞外基質，在慢性哮喘中，上皮層表面變得粗糙，平滑肌層增厚，兩層之間的間隔縮小[14]。實驗中，當HBEC培養在不含I型膠原的三維matrigel膠上，也形成類似平滑肌細胞的細胞團；當膠中存在I型膠原時，HBEC細胞之間明顯存在類似纖維帶的連接，顯示I型膠原在促進分枝形態發生中的一個普遍性作用，見圖2(b)。同時，這兩種細胞在形態結構上的差異性，也提示了平滑肌細胞的特性包括力學性能促進了其特色分枝形態的發生。

圖2I型膠原調控三維膠上細胞分枝結構的形態發生(a).ASM細胞種植在純matrigel或matrigel+COL I(0.5mg/mL)形成的三維膠上，培養約16h后的形態發生；(b).人源的HBEC細胞種植在純matrigel或matrigel+COL I(0.5mg/mL)形成的三維膠上，培養約16h后的形態發生

Fig.2COL I mediates the branching morphogenesis of ASM cells(a).The morphology of ASM cells after cultured for16h on3D matrigel only or containing COL I (0.5mg/mL)；(b).The morphology of homo HBEC cells after cultured for16h on3D matrigel only or containing COL I (0.5mg/mL)

3.3 舒張劑異丙腎上腺素抑制平滑肌細胞分枝形態的發生

臨床的哮喘治療中，異丙腎上腺素(ISO)和氣道平滑肌細胞的β-激動劑受體結合，對氣道有快速舒張作用。我們在實驗中檢測了異丙腎上腺素對平滑肌細胞群體分枝形態發生的影響。見圖3，培養體系中存在100 μM ISO時，分枝形態很大程度上被抑制，150 μM ISO則起到了基本完全的抑制作用。這結果初步提示了I型膠原誘導氣道平滑肌細胞分枝結構的形態發生需要生物力學因素的參與。同時，該分枝形態模型也可能成為臨床哮喘藥物開發中，初步檢測氣道平滑肌舒張藥物作用效果的一個快捷的潛在模型。

4 討論

細胞群體形態學是個體發育和組織生物工程領域的一個重要研究方向。本研究初步探索了氣道平滑肌細胞在三維matrigel膠上的形態發生，證實三維膠培養和I型膠原是細胞自發生成分枝形態結構的必要微環境，實驗結果也初步提示該形態發生需要生物力學因素的參與。這些觀察為理解多細胞形態發生學提供了一定的素材。

臨床緩解哮喘癥狀的氣道舒張藥物異丙腎上腺素有效抑制了實驗模型中大鼠氣道平滑肌細胞的分枝結構形態發生。這從側面提示，作為一個簡捷初步的測試模型，分枝結構的形態發生可能具有臨床氣道舒張藥物效果的檢測功能。作為一個輔助方法，該檢測模型將比常用的小鼠哮喘模型具有簡單、快速的優勢。

圖3舒張劑異丙腎上腺素(ISO)抑制平滑肌細胞分枝形態的發生(a).ASM細胞種植在三維matrigel+COL I膠上，培養基中存在對照DMSO，100μM或150μM ISO的條件下，培養約16h后細胞群體形態的發生情況；(b).在存在不同濃度ISO的培養條件下，用MTT分析法檢測24h后ASM細胞的存活率(mean+S.D.)，高吸光值(OD495nm)代表高存活率

Fig.3The airway relaxation reagent ISO inhibits the branching morphogenesis(a).The morphology of ASM cells after16h culture on3D matrigel with COL I in culture medium containing100μM or150μM ISO, or DMSO as control；(b).Detection of alive ASM cells by MTT assay (mean+S.D.) after24h culture in medium containing different concentrations of ISO.Higher absorptions at495nm represents higher alive rate

作為一種呼吸系統慢性疾病，全球約有3億哮喘患者，影響到人們正常的生活工作，而且哮喘發生率不因地區經濟水平的提升而下降[15]。研究和治療方面的進展主要體現在抑制氣道炎癥反應和減輕因氣道平滑肌層增厚而引起的氣道高反應性[16]。正常情況下，氣道平滑肌層具有收縮和舒張的生理功能，而在哮喘氣道高反應現象中，平滑肌層保持收縮狀態，導致支氣管通氣受阻，因此嚴重影響到患者的生活健康，甚至危及生命[17]。了解平滑肌層細胞的力學性能及其變化有助于理解氣道高反應現象的病理基礎，或許能為臨床治療甚至逆轉哮喘發病條件提供理論研究上的線索。我們的工作為研究氣道平滑肌的力學性能提供了一個簡便的模型。