探究南美蟛蜞菊不同器官浸提液對小球藻的化感作用*

鄭耀賢 ［北京師范大學（珠海）附屬高級中學 廣東珠海 519080］

小球藻（Chlorellasp.）是一類普生性單細胞綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、小球藻屬。小球藻具有生態分布廣，易于培養，生長速度快等優點，是進行生物技術研究和環境科學研究的好材料［1］。著名的卡爾文循環就是以小球藻為實驗材料，揭示了二氧化碳中的碳在光合作用中轉化為有機碳的途徑。

南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）為菊科蟛蜞菊屬植物，廣泛分布于我國華南地區及沿海部分地區，是當地危害嚴重的區域性入侵植物之一［2］。南美蟛蜞菊一般生長在道路、水溝、農田邊沿和濕潤草地等處,農民在清除田埂雜草時，常將其踩入水田中作為有機肥，或作為旱地作物的覆蓋綠肥，結果發現這種肥料對作物有很強的化感作用［3］，常導致作物長勢變差、產量降低等不良癥狀。

化感作用（allelopathy）是指植物通過向環境釋放特定的次生物質從而對鄰近其他植物（含微生物及其自身）生長發育產生的有益和有害的影響［4］。富營養化水體中藻類大量繁殖，利用植物間的化感作用抑制藻類生長的研究是環境生物學研究的熱點之一［5］。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 恒溫干燥箱、恒溫光照培養箱、電子天平、恒溫水浴鍋、冰箱、顯微鏡、血球計數板、移液槍、廣口瓶、錐形瓶、封口膜、紗布、濾紙、蒸餾水等。

1.2 藻種及培養 實驗所用藻種從校內池塘采集后經微生物純化培養所得，采用BG-11培養基進行培養，其組成為（L）：NaNO31.5g、K2HPO40.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·7H2O 0.036g、Na2CO30.02g、檸檬酸0.006g、檸檬酸鐵0.006g*微量元素溶液A51mL、氨芐青霉素（終濃度）50μg/mL、蒸餾水1000mL。［*微量元素溶液A5：H3BO42.86g、MnCl2·4H2O 1.81g、ZnSO40.222g、Na2MoO40.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co（NO3）2·6H2O 49.4g］

培養條件為（25±1）℃、光照強度為5000lx、連續光照。

1.3 南美蟛蜞菊根、莖、葉浸提液母液的制取南美蟛蜞菊洗凈自然風干后將根、莖、葉分離，分別剪碎，80℃干燥48h，得到根、莖、葉干品，各稱取1g 干品，研磨后分別加入40mL 蒸餾水，100℃水浴加熱30min，過濾定容至50mL，作為實驗母液，其相對濃度都為20g/L，置于廣口瓶，低溫保存。對照組不添加母液，每個處理重復3次［6］。

1.4 測量方法

小球藻細胞密度： 用血球計數板在光學顯微鏡（10×10）下計數。

小球藻細胞抑制率：南美蟛蜞菊根、莖、葉浸提液對小球藻的抑制率計算公式如下［7］：

［IR 為小球藻細胞抑制率（%）；N 為處理組細胞密度；N0為對照組細胞密度］

2 實驗步驟

1）取處于對數生長期的小球藻60mL，均分為3份，A、B、C 份各20mL。

2）將A 份小球藻平分為4份分別加入到4個100mL 錐形瓶中，標為A1、A2、A3、A4，再將根浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分別加入A1～A4中；將B 份小球藻平分為4份分別加入到4個100mL 錐形瓶中，標為B1、B2、B3、B4，再將莖浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分別加入B1～B4中；將C 份小球藻平分為4份分別加入到4個100mL 錐形瓶中，標為C1、C2、C3、C4，再將葉浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分別加入C1～C4中。最后分別加入BG-11培養基使培養體系總體積均為50mL。用植物材料的質量表示化感物質的含量（g/L），分別得到南美蟛蜞菊根、莖、葉濃度梯度為0g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L 的化感培養液。

3）將3組共12個培養體系放到恒溫光照培養箱中進行連續光照培養。每隔12h 搖蕩一次，連續培養7d，每天定時用血球計數板進行小球藻細胞密度顯微計數，記錄。

4）進行3次重復，采用Excel 整理數據，Origin6.5畫曲線。

3 結果與分析

3.1 南美蟛蜞菊根浸提液對小球藻種群密度的影響 南美蟛蜞菊根浸提液對小球藻種群密度的化感抑制作用比較明顯。如圖1-B，對照組的小球藻種群數量呈“S”型曲線增長，是典型的邏輯斯蒂增長模型，培養到第7天種群數量達到最大值且基本穩定。不同濃度的根浸提液處理后小球藻的增長曲線均出現明顯的變形，其中1g/L 和2g/L的處理組種群密度變化曲線接近重疊，且種群數量均出現下降，這說明1g/L 以上濃度的根浸提液小球藻種群數量有明顯的抑制作用。由圖1-A，可知不同濃度的根浸提液對小球藻的抑制率隨時間不斷提高，1g/L 和2g/L 的處理組培養的第7天其抑制率均達到接近80%，其半效應濃度（EC50）出現在第4天。綜合分析，高于1g/L 的根浸提液對小球藻有明顯的抑制效果。

圖1 南美蟛蜞菊根浸提液對小球藻種群密度的影響

3.2 南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻種群密度的影響 南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻種群密度也有明顯的抑制的作用。如圖2-B，0.5g/L 和1g/L的莖浸提液處理小球藻，小球藻種群密度隨時間依然接近“S”型的增長曲線，其抑制率都接近30%（如圖2-A），說明低濃度的莖浸提液對小球藻種群數量增長有一定的干擾。但進一步研究發現，在培養3天后，0.5g/L 莖浸提液對小球藻的抑制效果比1g/L 的效果略好，這與孔見凡［8］發現南美蟛蜞菊干莖浸提物對油菜種子萌發有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增高抑制作用減弱（0～1500mg/L）的結果一致。說明較低濃度莖浸提液對小球藻的抑制效應可能存在不同于葉和根的效應，但其機理尚不清晰，后續實驗建議可以進一步探究0.5g/L 前后的莖浸提液的抑制效果。2g/L 的莖浸提液對小球藻種群密度有顯著的抑制效果，其種群密度隨時間變化幾乎不增長，其抑制率高達60%，其半效應濃度（EC50）出現在第3～4天。

由圖1和圖2綜合分析認為，南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻的抑制作用也比較明顯，但不及根浸提液的抑制效果。若以莖為材料，建議使用2g/L 的莖浸提液處理小球藻。

圖2 南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻種群密度的影響

3.3 南美蟛蜞菊葉浸提液對小球藻種群密度的影響 南美蟛蜞菊葉浸提液在受試濃度范圍內對小球藻種群密度的抑制效果不是很明顯。如圖3-B，0.5g/L 和1g/L 的葉浸提液處理小球藻，與對照組的增長曲線幾乎重疊，都呈典型“S”型增長曲線，其中，在培養的前段時間甚至出現一定的促進作用，其促進率在5%左右（圖3-A）。2g/L 的葉浸提液對小球藻種群密度有一定的抑制作用，其抑制率最高可達45%，達不到半效應濃度（EC50），說明2g/L 的葉浸提液對小球藻不會造成明顯的抑制效果，后期建議增大葉浸提液的濃度進行進一步的探究。

圖3 南美蟛蜞菊葉浸提液對小球藻種群密度的影響

4 結論與討論

南美蟛蜞菊的根、莖浸提液對小球藻的種群密度均有明顯的抑制效果，其中根浸提液的抑制效果好于莖浸提液，1g/L 根浸提液對小球藻的抑制率高達80%。葉浸提液在受試范圍內對小球藻的種群密度的抑制效果不明顯，低濃度的葉浸提液對小球藻種群密度還有一定的促進作用。

本研究采用小球藻作為實驗材料，開展基于生態環境研究的綜合實踐探究活動，有利于發展學生的綜合能力，落實新課程標準“科學、技術、社會相互關系的教育”的教學建議，發展學生的創新精神和實踐能力。

開展基于項目的綜合實踐探究活動，學生在掌握基本技能的同時，嘗試運用種間關系的視角解決生態環境中的實際問題，極大提升了學生探究學習的興趣。這種基于科學大概念的學習，學生能感受到知識技能的切實意義，是指導學生開展真正學習的有效途徑，培養創新性人才的基礎。