金鐵鎖三萜皂苷合成生物學研究進展*

李畏嫻 ，張愛麗 ，錢子剛 ，陳 潔 ，孫 輝 ，陳永剛 ，劉 幸 △

（1.云南省昆明市第三人民醫院，云南 昆明 650041；2.云南中醫學院，云南 昆明 650500）

金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu是石竹科單種屬植物［1］，主要藥理作用為鎮痛、抗炎、抗類風濕、免疫調節、抑菌、抗氧化等。目前對金鐵鎖的研究主要集中在根部，其主要化學成分是三萜皂苷和環肽類化合物［2］，皂苷的母核結構為齊墩果烷型。近年來，對金鐵鎖化學成分的研究主要為三萜皂苷，較為集中的是齊墩果烷型五環三萜皂苷化合物，目前皂苷類成分被認為是主要活性成分之一［3］。金鐵鎖收錄入《中國植物紅皮書》中，屬國家二級保護植物［4］。目前，由于人工栽培技術還不完善，金鐵鎖藥材主要通過野生采挖，對野生植物資源造成嚴重破壞，且由于其自然分布區域狹窄且生長環境極其惡劣，導致自然分布資源迅速減少。通過化學合成或半化學合成其有效成分在一定程度上能降低成本，提高合成效率，但毒性大，工藝流程復雜，環境污染嚴重。基于合成生物學方法在微生物體內重建金鐵鎖三萜皂苷的生成途徑，實現金鐵鎖藥用有效成分生物合成途徑解析，并在此基礎上通過研究生物合成途徑和關鍵酶基因的挖掘鑒定與調控，通過金鐵鎖三萜皂苷人工細胞工廠開發直接發酵法生產金鐵鎖藥用有效成分。

1 有效成分

1.1 萜類化合物

萜類化合物又稱類異戊二烯，廣泛存在于植物界的一類天然烴類化合物，基本組成骨架為異戊二烯單元，分子式為（C5H8）n。根據所含異戊二烯數目分為單萜、倍半萜、雙萜、三萜、四萜、多萜等。次生代謝萜類化合物通常用作食品添加劑、農藥和藥物等，具有重要的經濟價值［5］。由黃花蒿中提取到了青蒿素，是治療瘧疾的強有效藥［6］。在臨床，中藥中所含有的萜類化合物為重要有效成分。近年的研究表明，樺木酸及其衍生物具有較多生物活性，對多種腫瘤細胞有較強毒殺效應而對正常細胞無殺傷力［7］。萜類生物合成途徑是生物體內主要的代謝途徑，隨著萜類化合物的發現及其在生活、生產中的應用，其生物合成途徑的研究也受到極大關注。

1.2 三萜類化合物

三萜類化合物是由6個異戊二烯結構單元聯結而成，多數含30個C原子，大多數三萜皂苷元以五環三萜形式存在。五環三萜皂苷元的碳架主要有齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型、木栓烷型［8］等。三萜類化合物是中草藥中的重要有效成分，其生物合成途徑為甲羥戊酸途徑（MVA）。目前，對五環三萜化合物的研究主要集中在齊墩果酸。

1.3 三萜皂苷的合成生物學

齊墩果烷廣泛存在三萜植物中，主要以苷的形式存在，但亦有以游離狀態形式存在。其中分布較廣的皂苷元為齊墩果酸，存在于中藥女貞子和青葉膽全草中，具有降轉氨酶作用，是治療肝炎的有效藥物［9］。大部分植物中都有五環三萜皂苷，在植物中最主要的功能是防御病原體和害蟲；在人體中可增強藥用植物有效成分的產生，提高藥用價值。齊墩果烷類三萜化合物具有抗癌、抗病毒、抗氧化及保肝等作用，如齊墩果酸作為齊墩果烷型五環三萜的標志性化合物，具有抗炎［10］、抗腫瘤［11］、抗變態反應、促進肝細胞再生［12］和促進肝糖原合成［13］的重要生理活性，但自然界中每個植物所含齊墩果酸的含量均較低，目前的來源主要是通過從植物中提取和化學合成的方法來獲得，非常不利于環境和資源的可持續發展，利用合成生物學的原理和方法，可實現藥用資源的可持續利用。

2 生物合成途徑

2.1 MVA途徑

三萜皂苷生物合成途徑主要是分為前體形成、骨架構建、后期修飾三部分（見圖1）。碳源經過MVA途徑合成萜類基本前體，再由萜類合成酶催化合成三萜類骨架后，再由CYP450酶及UGT酶對骨架的結構進行修飾，最終獲得相關的三萜類皂苷化合物。有學者將2，3-環氧角鯊烯作為三萜皂苷生物合成途徑上游和下游途徑的分支點，三萜皂苷的后期修飾酶在其生物合成途徑中作為關鍵酶基因，是產生萜類次生代謝最終產物的關鍵。

2.2 關鍵酶基因

前期研究中，已成功地在釀酒酵母中完成MVA途徑的優化，在參與三萜皂苷生物合成下游途徑的關鍵元件中，參與植物體內多種生命活動獲得參與三萜皂苷生物合成細胞色素CYP450單加氧酶為關鍵酶基因。植物細胞中，CYP450為催化初級和次級代謝反應作用的催化劑，可參與各類化合物的合成與代謝反應［14-15］。CYP450是在環氧角鯊烯合成不同構型的母核后進行一系列的結構修飾，包括羥基化、醛基化、酮基化、羧基化和脫氧脫水等氧化反應［16］。CYP450參與催化合成多種具有藥用價值的次生代謝產物，如皂苷［17-18］、青蒿素［19-20］、紫杉酚［21］、黃酮類化合物［22］、莨菪堿［23］等。

研究至今，大豆來源的GmCYP93E1基因是最早被證實具有催化合成三萜化合物的CYP450，其催化合成齊墩果 -12- 烯 3，24- 二醇［17］。甘草中的 CYP88D6 和CYP72A154基因可催化甘草次酸的合成，并參與甘草酸苷的生物合成［24-25］。葡萄來源的 VvCYP716A15和VvCYP716A17在生物合成途徑中，催化β-香樹脂生成齊墩果酸，又催化羽扇豆醇合成燁木酸［26］。來源于蒺藜狀苜蓿的基因MtCYP716A12在生物合成途徑中的作用是催化齊墩果酸的合成［18，26］。從人參中克隆到的基因PgCYP716A4，PgCYP716A52v2，PgCYP716A53v2 參與人參皂苷合成途徑［27-29］，在生物合成過程中，人參來源的CYP450基因依次發揮自己的催化作用，PgCYP716A47可以催化達瑪烯二醇合成原人參二醇，PgCYP716A53v2催化原人參二醇合成原人參三醇，PgCYP716A52v2催化合成齊墩果酸型皂苷（見圖2）。

3 合成生物學

3.1 常用菌株

在合成生物學的運用過程中，有較多的微生物可作為度盤菌株的使用，如完成全基因測序的釀酒酵母，遺傳背景清晰的大腸桿菌、鏈霉菌，能產阿維菌素的阿維鏈霉菌、天藍鏈霉菌、惡臭假單胞菌等一系列的微生物。

3.2 底盤菌株選用-釀酒酵母

釀酒酵母具有遺傳背景清楚，發酵密度大，生物安全性好，遺傳改造和發酵方法成熟等優點，因此在工業生產中常選擇為底盤菌株的微生物，在基因工程、遺傳學分析及蛋白表達研究領域被廣泛應用［30-31］，因安全、無毒、不致病等優點被廣泛應用于食品與醫療衛生領域。1996年已完成了對釀酒酵母的全基因組測序工作［32］。在釀酒酵母中開展了酵母基因敲除技術、酵母基因定位技術、酵母功能基因芯片技術等［33］。利用釀酒酵母可以很大程度地闡明高等真核生物基因表達調控的基本原理及基因編碼產物結構與功能間的關系，從而起到表達鑒定或異源表達目的蛋白的作用［34-35］，建立了酵母表達系統。

圖2 參與三萜合成的CYP450s

釀酒酵母體內自身含有提供萜類化合物合成的MVA途徑，能代謝合成以麥角甾醇為主要產物的固醇類物質［36］，能用來生產高修飾型外源天然產物如β-香樹脂［37-38］，因而廣泛用于構建生產天然產物的底盤工程菌株［39］。目前，構建釀酒酵母基因工程菌，建立細胞工廠高產所需有效成分已成為研究主流，而且已有很多成功構建天然產物細胞工廠的實例，如Keasling團隊利用合成生物學的方法在酵母中合成青蒿素的前體物青蒿酸，產量可達 25 g ／L［20］。目前，釀酒酵母菌在青蒿酸生物合成路線比較清晰的基礎上，采用一系列的基因調控方法，通過酵母代謝工程菌合成了青蒿酸，其產量超過100 mg／L，實現了在酵母中大量合成抗瘧藥物青蒿素的前體物質［20］。DAI 等［40-41］已在釀酒酵母底盤細胞成功構建了原人參二醇的生物合成途徑。構建釀酒酵母工程菌株，能快速高產藥用有效成分或其中間體［19］，為瀕危藥材的保護和可持續利用提供應用基礎。HAN等［28］利用釀酒酵母成功構建了人參中原人參二醇合成酶基因CYP716A47的異源表達鑒定菌株，完成了人參中的達瑪烯二醇合成酶基因PgDDS與原人參二醇合成酶基因CYP716A47的異源共表達，實現了利用釀酒酵母培養體系自身所含底物產目標化合物。可見，釀酒酵母為三萜皂苷的異源代謝合成提供了表達系統，為實現代謝工程中三萜皂苷異源工業化生產提供了研究思路。在本實驗研究中重點研究金鐵鎖有效成分三萜皂苷合成的下游途徑，故選擇釀酒酵母作為底盤菌株。

4 小結

金鐵鎖的藥理作用主要表現為鎮痛、抗炎、抗類風濕、免疫調節、抑菌、抗氧化等。近年對金鐵鎖的研究所獲皂苷類成分，目前被認為是主要的活性成分，較為集中的是齊墩果烷型五環三萜皂苷化合物［3］。目前，利用合成生物學在釀酒酵母中構建細胞工廠高效生產藥用植物有效成分已成為最環保、高產的手段。釀酒酵母體內自身含有提供萜類化合物合成的MVA途徑，以其作為底盤菌株，在細胞色素P450單加氧酶對骨架進行結構修飾下，最終獲得相關的三萜類皂苷化合物。

實驗室前期已完成了金鐵鎖轉錄組測序及生物信息學分析工作，并完成了MVA途徑的修飾與合成，在酶的催化下，構建出了高產金鐵鎖有效成分三萜皂苷的前體物質齊墩果酸的工程菌株，再在釀酒酵母中實現金鐵鎖三萜皂苷元生物合成途徑異源重建，將金鐵鎖P450單加氧酶通過合成生物學方式將其在釀酒酵母中表達實現重建，構建出高產藥用植物金鐵鎖有效成分的初級細胞工廠。

綜上所述，基于合成生物學方法在微生物體內重建金鐵鎖三萜皂苷的生成途徑，實現金鐵鎖藥用有效成分生物合成途徑解析，并在此基礎上通過研究生物合成途徑和關鍵酶基因的挖掘鑒定與調控，可增加藥用植物有效成分的含量，提高中藥材的品質，為中藥的良種選育、規范化種植和質量控制提供技術支撐。同時，通過金鐵鎖三萜皂苷人工細胞工廠的開發直接發酵法生產有效成分，是獲得新資源的又一重要補充。