藥品輔料蜂蜜的微生物檢查方法研究*

周志云，由亞寧 ，馬鵬飛，吳 晗，趙 冉

（1.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710061； 2.西安京西雙鶴藥業有限公司，陜西 西安 710061；3.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

蜂蜜是天然的防腐劑、黏合劑［1-3］，具有較高營養價值和功效［4-5］。明代李時珍《本草綱目》云：“蜂蜜，其入藥之功有五：清熱也，補中也，解毒也，潤燥也，止痛也”［6］。其作為中藥輔料使用在我國歷史悠久。本研究中參照2015年版《中國藥典（四部）》非無菌產品微生物限度檢查法［7-8］，用5種微生物代表菌株，加入不同含糖濃度的蜂蜜中，采用平皿法試驗，確定其抑菌性與含糖濃度的關系。現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HFsafe-1200 LC型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；BS2202S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（天津鑫博得儀器有限公司）；LRH-250B型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；霉菌培養箱（重慶四達實驗儀器廠）；VITEK2型全自動微生物鑒定系統（法國梅里埃有限公司）；CH型三目顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］和黑曲霉［CMCC（F）98003］均源于中國醫學細菌保藏管理中心，工作用菌株為第2代。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號為170325），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號為170316），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號為170329），沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號為160316），均購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.4 供試品

槐花蜜（批號為20171108，玻璃瓶裝，陜西春秋食品有限公司）；棗花蜜（批號為20171206，玻璃瓶裝，陜西秦嶺蜂業有限公司）；秦嶺紫椴雪蜜（批號為20180428，玻璃瓶裝，陜西春秋食品有限公司）。

2 方法與結果

2.1 試驗菌種鑒定

按照VITEK2型全自動微生物鑒定系統操作規范，將5種試驗菌株分別進行增菌、分離、純化，并進行革蘭染色、鏡檢。以無菌方式挑取分純菌落置3 mL 0.45%NaCl試管中，采用比濁儀調整菌液濃度至規定菌懸液濃度。根據各個菌株革蘭染色結果選定相應鑒定卡片，按順序放在載卡架上，輸樣管插入菌液管中。將載卡架放入儀器的填充倉，關閉倉門，進行鑒定培養。結果顯示，均檢出標準菌株。

2.2 試驗菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于TSB中，35℃培養24 h；將白色念珠菌接種于SDB中，25℃培養3 d；將黑曲霉接種于SDA中，25℃培養7 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。采用10倍稀釋法將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉分別稀釋至含菌量為104cfu／mL的試驗菌液。

2.3 培養基適用性檢查

取不大于100 cfu的標準菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，分別接入測試與對照培養基，經規定溫度、時間培養，測試結果與對照培養基平均菌落數的比值應為0.5～2.0，且菌落形態、大小應與對照培養基上的菌落一致；被檢液體培養基管與對照培養基管比較，試驗菌生長良好。培養基適用性檢查符合2015年版《中國藥典（四部）》附錄檢查方法。

2.4 平皿法驗證試驗

供試液制備：取3個品種的蜂蜜（槐花蜜、棗花蜜、椴樹蜜）各 15，25，40，55，70，80mL，分別加 TSB 至 100mL。45℃恒溫振搖15 min使其溶解均勻，制成6種含糖濃度分別為 11.25%，18.75%，30.00%，41.25%，52.50%，60.00%的供試液。

試驗組溶液制備：取3個品種蜂蜜的6種不同含糖濃度的供試液，各分裝于5個無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，再分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌液各0.1 mL。

菌液對照組制備：將TSB分裝于5個無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，同試驗組操作，分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液各0.1 mL。

供試品對照組制備：取供試液9.9 mL，加入TSB 0.1 mL。

回收率試驗：分別取上述試驗組、菌液對照組和供試品對照組溶液各1 mL，置直徑為90 mm的培養皿中，注入TSA或SDA，混勻，凝固，TSA平板在35℃培養3 d，SDA平板在25℃培養5 d，計數。供試品5種試驗菌的回收率均需進行3次重復試驗，若供試品5種試驗菌的回收率均為0.5～2.0，供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗通過。供試品回收率（%）＝（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）／菌液對照組菌落數。試驗結果見表1和表2。

表1 霉菌和酵母菌總數回收率平皿法測定結果

2.5 回收率曲線圖

需氧菌總數回收率詳見圖1，霉菌、酵母菌總數回收率詳見圖2。可見，3種不同蜂蜜隨著含糖濃度（含糖分數）的升高對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均有不同程度的抑制作用，槐花蜜和椴樹蜜在含糖濃度大于40%時對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌回收率試驗呈顯著下降趨勢。而棗花蜜在含糖濃度30%以上時金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的回收率便呈下降趨勢。3種蜂蜜對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑制作用不明顯，均為 0.5～2.0，符合 2015 年版《中國藥典》要求。3種不同蜂蜜對白色念珠菌有較明顯的抑制作用，槐花蜜和椴樹蜜在含糖濃度40%以上時回收率呈下降趨勢，棗花蜜在含糖濃度30%以上時回收率呈下降趨勢。3種蜂蜜對黑曲霉的抑制作用不明顯，均為0.5～2.0。與需氧菌總數回收率試驗中的白色念珠菌與黑曲霉的回收率測定結果一致。

表2 需氧菌總數回收率平皿法測定結果

圖2 霉菌、酵母菌總數回收率曲線圖

3 討論

采用平皿法對6個不同含糖濃度的3種蜂蜜進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數回收率測定，試驗結果說明，隨著蜂蜜含糖濃度（含糖分數）的增加，各組試驗菌回收率均呈降低趨勢。含糖濃度高的蜂蜜對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、酵母菌均有較強抑制作用，而對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑制作用相對較弱。

本研究中的蜂蜜是一種飽和甚至過飽和糖溶液［9-10］，具有很高的滲透特性（吸水性）［11］。在高滲性環境下，足以使微生物等細菌大量脫水死亡，因此蜂蜜的高含糖濃度直接影響微生物生長［12］。蜂蜜是天然的防腐劑，在中成藥及大、小蜜丸等添加蜂蜜制劑的藥品生產中，因無具體用量及濃度標準規定，有可能存在使用蜂蜜用量過度等情況，導致被輕度污染的微生物受到高糖濃度蜂蜜抑制，使藥品微生物檢驗中出現假陰性結果，從而對藥品質量的判定帶來影響。

2015年版《中國藥典》對輔料蜂蜜的標準未明確規定，建議研究制訂輔料蜂蜜及相關技術領域的標準，以更好地規范制藥行業的生產行為，確保藥品質量安全。