高效液相色譜法同時測定靈芝糖漿中4種成分*

薛 平，黃強燕，李 莉，承 晨，張佳莉，王倬，姚 曉，顧崢嶸

（江蘇省常州市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 常州 213000）

靈芝糖漿是由靈芝制成的單方制劑，功能養心安神、健脾和胃，用于心悸、失眠、食欲不振及神經衰弱。其制備工藝主要是將靈芝粉碎成粗粉，照流浸膏劑與浸膏劑項下的滲漉法，用80%乙醇作溶劑，浸漬1周后，緩慢滲漉至無色，收集滲漉液，回收乙醇；藥渣加水煎煮2次，每次2 h，合并煎液，濾過，濾液與滲漉液合并，濃縮至相對密度為 1.16～1.18（60 ℃），加入蔗糖 600 g及苯甲酸鈉適量溶解后，濾過，加水調整總量至1 000 mL，攪勻，即得［1-3］。靈芝含有多糖類、氨基酸、多肽、三萜類、生物堿等多種化學成分，具有鎮靜安神、降血糖、保肝解毒、抗腫瘤、免疫調節等作用，其中三萜類和多糖類化學物質被認為是主要有效成分，常作為衡量靈芝質量的依據［3-5］。目前靈芝糖漿質量控制仍執行《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第十七冊）》，無指標性成分控制。本研究中從三萜中的靈芝酸類成分角度出發，采用高效液相色譜（HPLC）法測定了市場上常見廠家不同批次的產品，為該制劑的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司），包括 LPG-3400SDN泵，WPS-3000型TLSL Analytical自動進樣器，TTC-3000RS型柱溫箱，DAD-3000型二極管陣列檢測器；XP105DR型電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

靈芝酸 C2（批號為 180517，含量為 98.19% ），靈芝酸 G（批號為 18032609，含量為 99.30%），靈芝酸 A（批號為18032603，含量為98.26%）均購于成都普菲德生物科技有限公司；靈芝酸B（北京世紀奧科生物技術有限公司，批號為171030，含量為98.15%）。水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

靈芝糖漿分別來自5個不同廠家，即江蘇新先制藥有限公司、江西省芙蓉堂藥業股份有限公司、大理白族自治州中藥制藥有限公司、株洲千金藥業股份有限公司和江西杏林白馬藥業有限公司，編號分別為A，B，C，D，E。詳見表 1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件［6-13］與系統適用性試驗

色譜柱：安捷倫Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL ／min；流動相：乙腈 -0.05 moL 磷酸二氫銨水溶液（27 ∶73，V/V），等度洗脫；柱溫：15 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。取線性關系考察項下同一濃度的混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖，靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B、靈芝酸A峰的理論板數均不得低于3 500，分離度均大于1.5。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

分別取靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B、靈芝酸A對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每 1 mL含靈芝酸 C2100.1 μg、靈芝酸 G 100.3 μg、靈芝酸 B 100.4 μg、靈芝酸 A 100.2 μg的混合對照品貯備液。精密量取25 mL樣品溶液，用乙酸乙酯振搖提取5次，每次25 mL，合并乙酸乙酯提取液，乙酸乙酯提取液回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。取空白試劑（水），按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取 2.2項下 3種溶液，進樣10 μL測定。陰性對照品溶液色譜中，在與對照品溶液及供試品溶液色譜峰相應處無4種被測組分的峰出現，陰性對照無干擾，專屬性良好（圖1）。

線性關系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品貯備液，精密吸取1，2，5 mL，分別置100 mL容量瓶；量取5 mL，置50 mL容量瓶，量取5 mL和8 mL分別置10 mL容量瓶。加入甲醇稀釋至刻度，制成6個不同質量濃度的對照品溶液，按擬訂色譜條件進行測定，進樣10 μL，以峰面積值（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標進行線性回歸。結果見表2。

表2 4種成分的線性回歸方程和線性范圍

精密度試驗：精密吸取線性關系考察項下同一濃度的混合對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進測定6次。結果靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B和靈芝酸A的峰面積RSD分別為 0.48%，0.80%，0.78%和0.42%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密量取樣品（編號X-1）25 mL，依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B和靈芝酸A峰面積的RSD分別為 1.70%，1.35%，0.73%，1.29% （n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密量取樣品（編號X-1）25 mL，依法制備供試品溶液，分別在 0，4，8，12，16，24 h 時測定。結果靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B和靈芝酸A峰面積的RSD分別為 1.59%，0.57%，0.73%，0.50% （n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：精密量取樣品15 mL（編號X-1），分別加入靈芝酸 C2（45.20 μg ／mL）1 mL，靈芝酸 G（102.7 μg ／mL）1 mL、靈芝酸 B（40.50 μg ／mL）0.5 mL和靈芝酸 A（81.10 μg／mL）1 mL，并稀釋至 25mL，依法制備供試品溶液，并測定含量，計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

精密量取不同廠家各批次靈芝糖漿樣品，依法制備供試品溶液，并測定含量。結果見表4。

3 討論

3.1 色譜條件優化

前期試驗參考文獻［6］，使用流動相為乙腈-0.04%甲酸溶液梯度洗脫相同的色譜柱，經過調整后未能使目標峰達到較好地分離，曾考察流動相乙腈與0.05 moL／L磷酸二氫銨水溶液［9］或各種酸（0.1% 磷酸、0.1% 甲酸和 0.1% 冰醋酸）［6-13］、流動相流速（0.8 mL ／min 和1.0 mL ／min）、柱溫（15，25，35，40 ℃）［9-12］，發現流速為0.8 mL ／min、流動相為乙腈 -0.05 moL ／L 磷酸二氫銨水溶液（27 ∶73，V/V）、柱溫為 15 ℃時，目標峰峰形較好，且分離效果較好，純度較高。檢測波長參考相關文獻并結合實際情況，發現在254 nm波長處目標峰有較大吸收［6-13］，適宜作為含量測定的檢測波長。曾考察不同品牌色譜柱［250 mm × 4.6 mm，5 μm 的色譜柱（安捷倫Zorbax Eclipse PLus C18色譜柱、安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱、島津InertsiL ODS-3液相色譜柱和沃特世Waters X Bridge色譜柱）］均能使目標峰達到較好的分離效果和純度。

3.2 提取條件優化

前期試驗發現，4種靈芝酸含量相對較高，故選取為測定指標性成分。由于樣品中4種靈芝酸含量普遍較低，且含有大量的蔗糖等水溶性物質，所以測定前需要提取純化，并濃縮樣品。供試品溶液制備過程前期，考察了不同的提取溶劑［13-16］（石油醚 30 ～60 ℃ 、石油醚60～90℃、乙醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和甲酸乙酯）、提取過程加不加酸（甲酸）、最佳溶劑的提取次數（2，3，4，5，6 次）。根據試驗結果、提取效率和使用便利性，發現無需加酸，采用乙酸乙酯萃取5次，就可達到較滿意的提取效果。

表 4 24批樣品含量測定結果（μg／mL，n＝3）

3.3 結果分析

試驗過程中發現，不同廠家的樣品含量具有顯著差異，生產廠家B（靈芝酸A）和生產廠家C（靈芝酸C2、靈芝酸A）2家的樣品部分靈芝酸已超出曲線范圍，推測可能由于原料和制劑工藝的差異性導致不同品牌之間含量差異顯著。測定了生產廠家A一批靈芝原料、樣品中間體，與廠家面對面交流后發現，在生產靈芝糖漿過程中，醇提滲漉液回收乙醇后，會出現大量的沉淀，為了后期樣品處理方便和得到最終完美清澈的溶液型樣品，棄去了大部分沉淀（脂溶性成分），對此部分沉淀的處理工藝控制不嚴，導致大量的靈芝酸類成分被棄去。這可能是同一品牌不同批次產品不穩定，不同品牌靈芝糖漿靈芝酸類含量差異較大的主要原因。

目前，該制劑標準僅檢測了相對密度，缺乏專屬性檢查，導致市面上缺乏對該制劑品質的衡量標尺，4種靈芝酸含量相對較高，具有代表意義，方法相對簡便，結果可靠，可為廠家靈芝糖漿質量控制與品質評價提供參考。