紅景天對2型糖尿病大鼠認知功能障礙的保護作用探討

王淑蘭，盧娟娟，張惠琴

（甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

糖尿病的慢性并發癥之一是認知功能障礙，糖尿病認知功能障礙極大地危害了人們的身體健康并嚴重影響著人們的生活質量[1]。2型糖尿病（T2DM）為目前對人類健康最具威脅的疾病之一，葡萄糖是大腦最主要的能量來源，正常情況下，線粒體利用葡萄糖為大腦提供能量，但在高血糖的情況下，線粒體利用葡萄糖產生大量的活性氧自由基，使機體發生氧化應激增加，腦細胞功能受損嚴重，出現認知能力下降[2-4]。2型糖尿病的另一基本特征是胰島素抵抗，無論是胰島素抵抗還是胰島素分泌不足都可以影響腦內葡萄糖代謝、腦細胞滲透壓的改變和神經營養不足，從而改變神經生理功能，導致認知功能障礙[5]。中樞神經系統產生胰島素抵抗，胰島素信號通路發生改變，出現了阿爾茨海默病（AD）特征性的病理變化，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積和老年斑的形成。Aβ對神經系統的毒性作用是使血管壁淀粉樣變直接導致血管硬化，彈性變差，甚至容易破裂或形成血栓，還誘使神經細胞凋亡，引發認知障礙，因此，防治AD發病的重要策略之一是抗氧化、抗凋亡。2型糖尿病由于糖利用障礙，引起體內大量自由基的形成，導致機體氧化應激反應明顯，引起血流動力學改變和微血管病變，并使血管動脈硬化明顯，造成血管狹窄，最終引起缺血、缺氧及神經損害，導致認知功能障礙的形成。

研究表明，胰島素不僅具有調節腦內新陳代謝、促進神經元的生長發育、調控腦內神經遞質釋放的作用，而且在認知等高級智能活動中起到了重要的作用。胰島素在大腦內的作用已成為海內外研究的熱點，關注胰島素抵抗與AD的關系可能為AD的早期防治提供有效的新途徑。

探討胰島素抵抗動物模型腦組織損傷及紅景天保護作用的相關機制，揭示AD等神經退行性疾病的發病機制并選擇有效的防治靴點提供理論依據，同時探究天然藥物多效性的特點，從天然藥物寶庫中發掘有效預防和治療記憶減退的藥物提供應用價值。以往研究證明，紅景天具有抗缺氧、抗炎和調節神經內分泌的作用[4-8]。紅景天的主要單體成分是紅景天苷，紅景天苷能否改善AD所致認知和記憶障礙以及其通過哪些機制發揮作用的研究報道很少。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性成年SD大鼠，體重250~350 g，從蘭州大學實驗動物中心購買，該實驗所有的操作及相關流程遵守蘭州大學醫學院動物實驗委員會的相關指導準則。第一周進行喂養以適應環境，采用嚙齒類動物飼料的喂食標準，晝夜周期為（8：00—20：00），自由進食飲水，室溫（22±2）℃。

1.2 藥物及主要試劑

鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）；紅景天干燥粉末（甘肅省中醫研究所）；血糖儀（三諾生物傳感技術有限公司）；血糖儀試紙條（三諾生物傳感技術有限公司）；大鼠解剖手術臺（北京合力科創科技發展有限公司）；胰島素試劑盒ELISA（上海博耀生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；Aβ酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海撫生實業有限公司）；1%戊巴比妥鈉（湖北鴻運隆生物科技有限公司）。

1.3 儀器

水迷宮視頻分析系統（中國醫學科學院藥物研究所）；低溫離心機（湖南湘儀實驗室開發有限公司）。

1.4 給藥方法及分組

24只8周健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，選取8只作為正常對照組（隨機），嚙齒類動物飼料喂食，其余用高脂高糖高蛋白飼料喂養8周作為T2DM模型組，腹腔內注射鏈脲佐菌素（STZ）27 mg/kg制備T2DM模型，30 min內注射完畢，正常對照組注射生理鹽水。腹腔注射STZ 3天后，眼底靜脈叢取血和制備血清，測定大鼠空腹血糖（FPG），血清胰島素含量用胰島素ELISA檢測試劑盒測定，采血前禁食14 h，其FPG≥11.1 mmol/L，判斷T2DM模型成功與否，造模成功后，各組大鼠按上述方法繼續飼養4周，根據文獻Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能[9]，將存在認知功能障礙的T2DM大鼠隨機分為兩組：AD組、紅景天干預組，兩組大鼠高糖高脂喂養，同時分別用等體積生理鹽水和紅景天苷（50 mg/kg/d）灌胃處理21天。正常對照組等量生理鹽水灌胃。各組大鼠每天上午10點對其進行灌胃，1次/d。

1.5 大鼠的認知功能用Morris水迷宮視頻分析系統檢測

實驗干預措施結束24 h內開始Morris水迷宮檢測[10]。水池直徑為160 cm，高50 cm，平臺直徑10 cm，高度30 cm。池壁上有N、E、S、W 4個等距離點，將水池分為4個象限，平臺可放在任意一個象限內，平臺置于水面下1 cm，水溫（25.0±1.0）℃，水中加入漂白劑，使水呈乳白色，在實驗期間迷宮外參照物不變。試驗前5天為訓練時間，第6天為測試。每天上、下午各訓練4次（間隔6 h），相鄰兩次訓練時間間隔為1 min。訓練時，入水點隨機選取，將各組大鼠面向池壁放入池中，記錄各組大鼠尋找到平臺并爬上平臺所用時間，即逃避潛伏期，如果大鼠在2 min內未能尋找到平臺，須將其人為引至平臺，此時潛伏期記為2 min。于第5天訓練結束后撤除水下平臺，于第6天將大鼠面向池壁于同一入水點放入池中，記錄逃避潛伏期和其在2 min內跨越平臺的次數。

1.6 檢測大鼠海馬組織中活性氧自由基（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）含量

各組大鼠于水迷宮實驗結束后，用1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/kg）進行腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動脈取血，分離血清后置于-20℃冰箱中備檢。每組大鼠取血后，立即斷頭取腦，分離海馬進行勻漿，取上清液，一部分置-20℃冰箱中備檢，一部分大腦海馬組織用于測定細胞內ROS和SOD含量。超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒和活性氧自由基（ROS）檢測試劑盒測定各組大鼠海馬組織內SOD和ROS含量，具體實驗方法見產品說明書。

1.7 血清和腦組織β淀粉樣蛋白（Aβ）含量檢測

按ELISA試劑盒操作說明測定血清和海馬組織中Aβ含量。

1.8 統計方法

實驗數據均采用SPSS20.0統計學軟件分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷對AD大鼠認知功能的影響

AD組逃避潛伏期明顯長于正常對照組（P＜0.05），跨越平臺的次數明顯少于正常對照組（P＜0.05）；紅景天干預組逃避潛伏期明顯短于AD組（P＜0.05），跨越平臺的次數明顯多于AD組（P＜0.05），紅景天苷能夠改善大鼠認知能力，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和跨越次數（±s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期和跨越次數（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與 AD 組比較，#P＜0.05

跨越次數（次）5.46±0.311.76±0.14*3.17±0.37#組別正常對照組AD組紅景天干預組逃避潛伏期（s）14.25±1.5640.96±3.26*25.04±32.58#

2.2 紅景天苷對AD大鼠海馬組織內ROS生成和SOD活性影響

大鼠海馬組織內ROS和SOD含量見表2。AD組大鼠海馬組織內SOD含量明顯低于正常對照組（P＜0.05），ROS含量明顯高于正常對照組（P＜0.05）；紅景天干預組大鼠海馬組織細胞內SOD含量明顯高于AD組（P＜0.05），ROS含量明顯低于AD組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠海馬SOD和ROS表達比較（±s）

表2 各組大鼠海馬SOD和ROS表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與 AD 組比較，#P＜0.05

ROS 210.14±9.67320.41±11.93*230.83±11.23#組別正常對照組AD組紅景天干預組SOD（U/mg）145.27±5.33103.18±4.28*121.33±2.18#

2.3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量比較

與正常對照組比較，AD組大鼠血清和海馬組織中Aβ含量顯著升高（P＜0.05），紅景天干預組與AD組比較，血清和海馬組織中Aβ 含量顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量（±s，μg/L）

表3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量（±s，μg/L）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與AD組比較，#P＜0.05

海馬Aβ 0.217±0.0240.672±0.057*0.324±0.064#組別正常對照組AD組紅景天干預組血清Aβ 2.632±0.5245.864±0.736*4.347±0.582#

3 討論

3.1 紅景天苷對T2DM所致AD大鼠模型認知功能障礙改善作用的實驗原理

AD認知功能受損早期主要表現是記憶減退和學習能力的降低，紅景天苷對T2DM所致AD大鼠模型認知功能障礙的改善作用采用Morris水迷宮實驗來評估[9-11]，用本研究方法來評估T2DM所致AD大鼠學習能力和記憶力是一種經典的工具。用逃避潛伏期來表示大鼠放入水中到找到隱匿平臺并爬上平臺所需時間。逃避潛伏期愈短，學習能力愈強，反映大鼠對空間認知能力的越高，具有認知功能障礙的大鼠則表現出逃避潛伏期越長。此實驗中，由于前期的強化訓練，大鼠對逃生平臺的具體位置有準確的記憶，撤去平臺后，大鼠將反復通過原隱匿平臺所在區域并試圖找到平臺，這種行為反映了大鼠對平臺位置的準確記憶能力和對前期經驗的記憶能力，此稱為記憶保持能力。

在此實驗的測評中，給予高糖高脂高蛋白喂養的AD組大鼠游泳軌跡繁亂、盲目，逃避潛伏期較正常對照組明顯延長。撤去水下隱匿平臺后，AD組大鼠在原隱匿平臺所在象限停留時間較正常對照組明顯延長，跨平臺次數明顯減少，表明大鼠空間定向、定位能力及記憶能力出現了顯著損傷，也表明T2DM模型組大鼠出現了認知功能障礙。在水迷宮實驗測評中，紅景天苷干預治療的AD模型大鼠在學習記憶能力方面，表現強于AD組大鼠。在各時間點紅景天干預組逃避潛伏期較AD組明顯縮短，在測試時間內跨平臺次數明顯增加。提示紅景天苷干預治療可較好地改善T2DM所致AD組的學習記憶功能。以上數據表明，紅景天苷對AD實驗大鼠模型的認知功能障礙具有很好的改善作用。

3.2 紅景天苷對糖尿病模型大鼠學習記憶能力及氧化應激的影響分析

超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）是氧化應激的標志物[12-13]。氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡，體內產生過多活性氧自由基（ROS），氧化程度超出氧化物的清除，從而導致組織損傷[14]。大量生成的ROS不僅直接攻擊細胞生物膜、誘導細胞凋亡甚至導致其壞死，而且ROS還可以作為第二信使，激活核轉移，進而增加半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員的酶活性，導致神經細胞的損傷和凋亡。ROS水平可直接反映細胞內氧化應激的水平。在生理情況下，體內氧自由基生成與清除保持一定的平衡。SOD是一種源于生命體的活性物質，是機體抗氧化平衡的重要指標[15]，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的超氧陰離子自由基，而超氧陰離子自由基具有細胞毒性，可使脂質過氧化，損傷細胞膜，引起炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機體衰老。因此，生物抗氧化抗凋亡機制中，SOD的地位愈來愈重要，對人體不斷地補充SOD具有抗衰老的特殊效果。

此實驗表明，大鼠海馬組織細胞內ROS生成明顯降低，由此提示紅景天苷在一定程度上能夠增加SOD活性而減輕氧化應激對神經元細胞所造成的損傷。

引起學習能力和記憶功能衰退又一重要病理因素是海馬組織細胞凋亡及功能受損。紅景天是一種高效的抗氧化的中藥。紅景天能夠修復氧化應激所造成的細胞損傷，從而提高大腦學習及記憶能力、改善腦細胞功能，從而改善和治療AD。

3.3 紅景天苷可以降低AD模型大鼠海馬組織中Aβ含量降低

高胰島素血癥時，胰島素與Aβ競爭性結合胰島素降解酶，使胰島素降解酶活性下降，導致Aβ降解減少，聚集的Aβ可以通過血—腦屏障進入中樞神經系統；反過來，Aβ的沉積又可阻礙胰島素信號的傳遞[12]。胰島素可調節Aβ的水平，胰島素抵抗可通過增加Aβ蛋白表達而導致認知功能障礙。同時，Aβ不能正常降解，逐漸沉積形成老年斑，誘導神經退行性變甚至凋亡，導致認知功能障礙[15-16]。

細胞內神經纖維纏結和細胞外β淀粉樣蛋白沉積和大量的神經元喪失是AD的主要病理特征。AD發病的中心環節是Aβ在腦組織細胞內的異常代謝和沉積。Aβ介導并參與多種神經毒副作用，尤其是氧化應激損傷、神經元凋亡危害最大。本實驗證實，在一定程度上紅景天苷能夠抑制T2DM的胰島素抵抗大鼠的海馬組織內ROS生成，提高SOD活性。紅景天苷減少Aβ在腦組織細胞內的異常代謝和沉積，提高神經元清除自由基的能力，從而減輕神經元的損傷，改善T2DM認知功能損傷[17-19]。