鉀營養(yǎng)調(diào)控?zé)煵轃焿A生物合成關(guān)鍵基因研究

李軍營 晉艷 王俊 蘇國興

摘要：為明確鉀營養(yǎng)供應(yīng)對煙堿生物合成的影響規(guī)律，采用定量PCR和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，研究不同供鉀量條件下，煙草葉片煙堿含量和根系腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）與喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（QPT）的表達情況。結(jié)果表明，低鉀供應(yīng)會增加煙葉的煙堿含量、促進根系PMT基因的表達;高鉀供應(yīng)對煙葉的煙堿合成和根系的PMT基因表達具有明顯的抑制效應(yīng)。低鉀處理后再恢復(fù)正常鉀供應(yīng)水平，可顯著降低由低鉀供應(yīng)對煙堿合成和PMT基因表達的促進作用。不同的供鉀水平同樣影響QPT基因的表達水平，但與煙堿積累量的變化不存在明顯的相關(guān)性。因此，煙草植株的煙堿含量受供鉀水平的影響，鉀可能通過控制根系腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達來影響煙葉中煙堿的積累。

關(guān)鍵詞：煙草;鉀營養(yǎng);腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶;喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶;煙堿;生物合成;關(guān)鍵基因相對表達量

中圖分類號：S572.06 ??文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0106-03

收稿日期：2018-05-07

基金項目：中國煙草總公司云南省公司資助項目（編號：2017YN06、2016YN05、2016YN28）。

作者簡介：李軍營（1978—），男，河北滄州人，博士，副研究員，主要從事煙草栽培研究。Tel：（0871）65106249;

通信作者：晉 艷，碩士，研究員，主要從事煙草栽培研究。Tel：（0871）65100188;

煙葉中的鉀離子參與煙葉的生理生化反應(yīng)，與煙株的抗逆性關(guān)系密切，對于煙草農(nóng)業(yè)來說，它還影響著煙葉的內(nèi)在品質(zhì)和工業(yè)可用性，通常把鉀含量作為衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。鉀對煙葉成熟度、香吃味、燃燒性、安全性等方面均有重要影響，鉀含量越高，往往煙葉的質(zhì)量越優(yōu)[2]。在鉀對煙堿積累的影響方面，不同學(xué)者的觀點不一致。左天覺認為，鉀對煙堿的積累幾乎沒有影響[3];胡國松等報道，高鉀施用量增加了上部葉中的煙堿含量[4];舒海燕等研究了施鉀對煙草農(nóng)藝性狀和煙堿含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施鉀可提高煙葉中鉀含量，促進植株生長，降低煙葉中煙堿含量[5]。然而關(guān)于鉀對煙堿合成的影響機制尚不清楚。Richards等研究表明，鉀營養(yǎng)與植物腐胺的積累有關(guān)，缺鉀可促進多種植物腐胺的積累[6-7]。由于腐胺是煙堿生物合成的前體物質(zhì)，鉀有可能通過腐胺影響煙葉煙堿的積累。為驗證這個假設(shè)，本研究采用砂培法，以不同濃度的鉀溶液處理煙草，并采用定量PCR技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，分析不同供鉀量對煙草煙堿含量和煙堿代謝關(guān)鍵酶腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（QPT）基因相對表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗用煙草（Nicotiana tabacum L.）品種為K326，由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。試驗于2015年在蘇州大學(xué)的陽光房內(nèi)進行，采用砂基培養(yǎng)法培育煙苗，蛭石和石英砂體積比為1 ∶1。煙草培育采用漂浮育苗法，培育至4葉期后，選取生長整齊的幼苗移入砂培塑料盆中。培育期間，晝溫平均為26.5 ℃，夜溫平均為18.3 ℃。在幼苗生長至8葉1心時，對煙株進行如下處理：（1）對照（CK）的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液（K+含量為0.23 mol/L）;（2）T1處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液中鉀元素（K）稀釋10倍;（3）T2處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液中K稀釋50倍;（4）T3處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液中的K擴大5倍;（5）T4處理為恢復(fù)組，即T2處理10 d后，再在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中恢復(fù) 10 d。由于Hoagland營養(yǎng)液中的K由KNO3提供，T1、T2處理因稀釋導(dǎo)致的氮素損失用NaNO3補足，調(diào)節(jié)pH值至5.8±0.1，每隔2 d換1次營養(yǎng)液。每盆栽植2株煙草，各處理均設(shè)6組重復(fù)。隨機選擇長勢均勻一致，沒有發(fā)生病蟲害的煙株，CK、T1、T2、T3分別在處理前及處理后10、20 d采集整株煙苗，T4在處理后直接取樣，其中葉片用于煙堿含量測定，根系用于PMT基因和QPT基因的表達分析。

1.2 營養(yǎng)指標(biāo)測定

將新鮮煙株用蒸餾水洗凈，并用吸水紙吸干表面水分，分別稱地上與地下部分質(zhì)量，低溫（-70 ℃）保存。

1.3 PMT和QPT定量PCR分析

取煙草根組織，在液氮中迅速研磨，采用Trizol-氯仿-異丙醇法[8]提取總RNA，并采用分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA進行檢測。用DNase I在37 ℃下處理RNA提取樣品20 min，以消除DNA干擾。將處理后的總RNA在65 ℃下變性5 min，向總體積為15 mL的總RNA反應(yīng)混合液中加入1 mL隨機引物（50 mmol/L）、4 mL 10 mmol/L dNTP，反應(yīng)體系中二者濃度分別為2.5、2.0 mmol/L，迅速冰浴冷卻。以提取獲得的總RNA，合成cDNA的第1條鏈。向反應(yīng)體系中加入4 mL 5×UltraScript RTase Buffer和1 mL UltraScript RTase Mix（含200 U/mL RTase，20 U/mL RNasin）后，在 30 ℃ 下預(yù)熱10 min，52 ℃下孵育60 min，隨后在70 ℃下滅活15 min，以降解逆轉(zhuǎn)錄酶。

用Primer Express software設(shè)計PCR引物，以煙草α-微管蛋白基因（GenBank登錄號為J421411.1）為內(nèi)參，該內(nèi)參基因的引物為α-tublin-F：5′-GGAACCTTACAACAGTGTCCT-3′，α-tublin-R：5′-CAAACCTCAACGAGCAGCAAC-3′;PMT基因（GenBank登錄號為D28506.1）的定量PCR引物為tPMT-F：5′-ACAGAGAATGGTGGATTTCC-3′，tPMT-R：5′-CGATTGAAGGATAACGAAGC-3′;QPT基因（GenBank登錄號為AB038494.1）的定量PCR引物為tQPT-F：5′-CAGCAATAGCCACCAAGAATAC-3′，tQPT-R：5′-TGTCGCCTTACAAGTCACATC-3′。

上述所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所用熒光染料為Thermo SBYR GREEN qPCR Master Mix（ROX included）。用兩步法PCR擴增程序進行PCR擴增：50 ℃ 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）預(yù)處理2 min，95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸60 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法[9]進行分析。

1.4 煙堿含量的測定

取煙草中部新鮮葉樣，105 ℃殺青后，70～80 ℃烘干，過60目篩，取0.3 g（精確至0.000 1 g）試樣，根據(jù)YC/T 383—2010[10]，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，測定煙堿含量，所用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀型號為7890B/5977A GCMS（美國Agilent公司），煙堿標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA公司。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0軟件經(jīng)one-way ANOVA分析后，進行Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供鉀水平對煙株營養(yǎng)生長的影響

從圖1可以看出，含不同濃度鉀離子的營養(yǎng)液對煙草營養(yǎng)生長的影響存在顯著差異。與對照相比，煙草地上部分與地下部分鮮質(zhì)量均隨鉀供應(yīng)水平的降低而減少。與對照相比，低鉀水平T1處理和T2處理煙草的地上部分、地下部分鮮質(zhì)量分別減少30.40%、37.64%和42.93%、57.03%，且對照與T1、T2處理間的差異達到顯著水平。高鉀水平T3處理煙草地上部分與地下部分的營養(yǎng)生長也顯著低于對照。

由圖2可知，隨著鉀離子濃度的恢復(fù)，地上部分和根系的營養(yǎng)生長可部分恢復(fù)。

2.2 不同供鉀水平對煙草葉片煙堿積累的影響

由圖3可知，在對照生長條件下，煙草葉片的煙堿含量隨著植株的生長顯著增加，與0 d相比，生長10、20 d后，煙堿含量分別增加24.17%、61.91%。

不同供鉀水平對煙草葉片煙堿積累的影響如圖4所示，隨著鉀離子濃度的降低，煙堿的積累量顯著增加，處理后 10 d，T1、T2處理分別比對照顯著增加3.60%、10.50%;而高鉀水平T3處理對煙堿的積累則具有顯著的抑制作用。對T2處理10 d后煙草進行鉀恢復(fù)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鉀離子濃度的恢復(fù)，煙草葉片的煙堿含量隨之減少，較恢復(fù)前降低 13.30%。不同供鉀水平下煙草的煙堿積累量與溶液中的鉀離子濃度呈明顯負相關(guān)關(guān)系，即低鉀水平會促使煙株大量積累煙堿，而高鉀處理會抑制煙株體內(nèi)煙堿的合成。

2.3 不同供鉀水平對PMT、QPT基因表達的影響

2.3.1 不同供鉀水平對PMT基因表達的影響

由圖5可知，在生長前期，煙草植株有較高的PMT基因表達水平，且隨著煙株的生長，表達量逐漸增強，不同測定時間之間的差異達顯著水平。

由圖6可知，處理后10 d，不同鉀離子供應(yīng)水平的營養(yǎng)液對煙草PMT基因的表達影響顯著，隨著鉀離子濃度的降低，PMT基因表達水平顯著升高，T1、T2處理分別比對照增加12.89%、18.93%，;相反，T3處理的PMT基因表達被顯著抑制。對T2處理10 d后煙草進行鉀恢復(fù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鉀離子濃度的恢復(fù)，煙草根系中的PMT基因表達量顯著下降，較恢復(fù)前下降37.37%。不同供鉀水平下煙草根系中的PMT基因表達水平與脅迫溶液中的鉀離子濃度呈明顯負相關(guān)關(guān)系，即低鉀水平會促進煙草根系PMT基因表達量的增加，而高鉀處理會抑制PMT基因在煙草根系中的表達。

2.3.2 不同供鉀水平對QPT基因表達的影響

由圖7可知，在生長前期，煙草根系中的QPT基因表達量較高，隨著煙株的生長，QPT表達量呈逐漸下降的趨勢，表現(xiàn)出明顯的表達時間特異性。圖8為不同供鉀水平對煙草根系喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達的影響。與PMT基因不同，QPT基因的表達水平較低，且隨著供鉀水平的降低呈先升高后下降趨勢，而5倍高鉀處理與低鉀處理相比對QPT基因表達量有一定程度的上調(diào)作用，但差異不顯著。連續(xù)低鉀（T2處理）脅迫20 d，根系中QPT基因的表達量達到最低值;對T2處理10 d后煙草進行鉀恢復(fù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QPT基因表達量能基本恢復(fù)。

3 討論

煙堿在煙草根中合成后，經(jīng)木質(zhì)部運輸?shù)饺~片，貯存在液泡中[11-13]。由于煙葉煙堿含量約占其生物堿總量的90%，煙堿含量的高低影響著煙草的品質(zhì)[14]。本研究結(jié)果表明，鉀離子供應(yīng)水平與煙葉煙堿的積累量呈負相關(guān)關(guān)系，提高鉀離子濃度能有效降低煙草煙堿的積累量。同時還發(fā)現(xiàn)，鉀離子供應(yīng)水平與煙草根系中的PMT基因表達量呈負相關(guān)關(guān)系，即低鉀會促進PMT基因的表達，使煙草大量積累煙堿，而較高的鉀離子濃度，則會使PMT基因表達量下降，?進而降低煙堿

的積累量。研究后期QPT基因表達水平較低，說明鉀可能不通過調(diào)控QPT基因的表達來調(diào)控?zé)焿A類物質(zhì)積累。鉀供應(yīng)水平與煙堿積累和PMT基因表達的這種調(diào)節(jié)關(guān)系，被低鉀處理后的恢復(fù)試驗結(jié)果進一步驗證，隨著供鉀水平的恢復(fù)，PMT基因表達量下降，煙堿積累量隨之減少。鉀營養(yǎng)與植物的腐胺代謝有關(guān)[6-7]，而腐胺是煙堿生物合成關(guān)鍵酶PMT的作用底物，其可在底物水平上影響酶的活性，進而影響煙堿的積累。本研究結(jié)果表明，鉀可能通過影響PMT基因的表達來影響煙堿的積累。至于鉀調(diào)節(jié)PMT基因表達的機制尚需深入研究。

有關(guān)鉀營養(yǎng)對煙堿積累的影響已有大量的報道，基本結(jié)論是土壤的供鉀水平與煙株生長和煙葉煙堿含量關(guān)系密切，但對于供鉀水平與煙堿含量確切關(guān)系的結(jié)論尚不統(tǒng)一[3-5]。

本研究結(jié)果顯示，與對照相比，隨著營養(yǎng)液中鉀離子濃度的降低，煙株地上與地下部分的鮮質(zhì)量隨之降低，煙堿含量略有升高;鉀離子濃度為對照組的5倍時，營養(yǎng)生長亦呈現(xiàn)下降趨勢，煙堿含量略有下降，這可能是因為營養(yǎng)液中鉀離子濃度過大時，會影響植株對其他離子的吸收，進而影響煙株的營養(yǎng)生長和煙堿的合成[15]。可見，低鉀水平可促進煙葉中煙堿的合成，而高鉀水平的作用則相反。

本研究發(fā)現(xiàn)，鉀離子可能通過影響PMT基因的表達來影響煙草中煙堿的積累，前人鮮有報道。在生產(chǎn)實踐中，本研究可為低鉀土壤通過增施鉀肥來調(diào)控?zé)焿A含量和提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]閆慧峰，石 屹，李乃會，等. 煙草鉀素營養(yǎng)研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2013，15（1）：123-129.

[2]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所. 中國煙草栽培學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：321-323.

[3]左天覺. 煙草的生產(chǎn)、生理和生物化學(xué)[M]. 朱尊權(quán)，譯.上海：上海遠東出版社，1993：306-352.

[4]胡國松，王志彬，王 凌，等. 烤煙煙堿累積特點及部分營養(yǎng)元素對煙堿含量的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（1）：10-14.

[5]舒海燕，楊鐵釗，曹剛強，等. 煙葉鉀含量與煙株農(nóng)藝性狀和煙堿含量的相關(guān)分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（2）：275-278.

[6]Richards F J，Coleman R G. Occurrence of putrescine in potassium deficient barley[J]. Nature，1952，170（4324）：460.

[7]Watson M B，Malmberg R L. Regulation of Arabidopsis thaliana（L.）heynh arginine decarboxylase by Potassium deficiency stress[J]. Plant Physiology，1996，111（4）：1077-1083.

[8]丁福章，李繼新，袁有波，等. 煙草不同組織總RNA的提取方法初探[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（12）：98-101.

[9]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[10]國家煙草專賣局. 煙草及煙草制品 煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法：YC/T 383—2010[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[11]Dawson R F. Accumulation of nicotine in reciprocal grafts of tomato and tobacco[J]. American Journal of Botany，1942，29（1）：66-71.

[12]Tso T C，Jeffrey R N. Studies on tobacco alkaloids：II.The formation of nicotine and nornicotine in tobacco supplied with 15N[J]. Plant Physiology，1957，32（2）：86-92.

[13]Saunders J A. Investigations of vacuoles isolated from tobacco：I. Quantitation of nicotine[J]. Plant Physiology，1979，64（1）：74-78.

[14]Saitoh F，Noma M，Kawashima N. The alkaloid contents of 60 nicotiana species[J]. Phytochemistry，1985，24（3）：477-480.

[15]張一揚，肖漢乾，李明德，等. 鉀素營養(yǎng)對烤煙生長及養(yǎng)分吸收的影響[J]. 土壤通報，2004，35（4）：466-469.