小鼠慢性牙周炎模型中脾臟細胞表面分子及Th1、Th2型細胞因子的檢測

汪育娟 杜鵑 江義笛 陳筑△

(1.貴陽市口腔醫院牙體牙髓病科，貴州 貴陽 550001；2.東陽市中醫院，浙江 金華 322100)

慢性牙周病是人類口腔疾病中最常見的感染性疾病之一，在我國35～44歲的成人中，慢性牙周病的發病率高達97.2%[1]。隨著慢性牙周炎的不斷進展，在牙周炎晚期時，可以因牙周支持組織及牙槽骨的大量喪失導致牙齒脫落，這也是目前我國成人失牙的首要原因。有研究[2]證實，在慢性牙周炎的發病過程中，宿主對致病菌的免疫應答的異常，與嚙齒類動物慢性牙周炎發生、發展有密切的關系。因此，本實驗通過檢測慢性牙周炎小鼠模型中，免疫細胞—脾臟細胞表面分子的表達情況及小鼠血清中各型細胞因子的變化情況，探討相關因子在牙周炎發展過程中的作用，為進一步理解慢性牙周炎的發病機制及免疫調節治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑及儀器 腦心浸萃液態培養基(BHI，廣州環凱)；氯化血紅素(Sigma，美國)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液(南京，建成)；FACS Calibur(Becton，Dickinson and Company，美國)；anti-mouse FITC-CD11b流式抗體(eBioscience，美國)；小鼠IFN-γ，IL-6，IL-10，TNF-α的ELISA檢測試劑盒(深圳晶美)。

1.2實驗動物和細菌菌株 選用健康C57BL/6小鼠，6～8周齡12只，雌性，無齲壞及牙周疾病，咬合關系正常。將小鼠分為兩組，PBS對照組和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas.Gingivalis，P.Gingivalis)組。于室溫、相對濕度平均為50%且通風、無菌條件下正常喂養飼料，自由飲水攝食。動物利用細菌(或PBS)持續感染1周：每天利用棉棒蘸取菌液涂抹于小鼠口腔及牙面、牙齦溝處，每次感染1 h后再給予食物和飲水。將P.GingivalisATCC33277接種于含0.5%氯化血紅素的BHI血瓊脂培養基上，于37 ℃厭氧培養箱(10% CO2、10% H2、80% N2)培養5～7 d，待培養基表面可見明顯黑色菌落，革蘭染色形態檢查為純培養物時，刮取菌落，重懸至BHI液體培養基內，培養24 h后，于紫外分光光度計600 nm處測定并計算細菌濃度(CFU/mL)。制備成109CFU/mL的菌液用于小鼠口腔、牙面和牙齦溝的感染。實驗4周后，取小鼠外周血，將小鼠吸入CO2后處死取脾臟組織。

1.3流式細胞術檢測脾臟細胞表面分子 分別取感染組、對照組小鼠的脾臟，制備成脾臟組織單細胞懸液，分別加入FITC標記抗CD11b抗體，4 ℃避光染色30 min后，250 g離心10 min，流式緩沖液洗滌3次。100 μL流式緩沖液重懸后，采用流式細胞儀檢測，Flowjo 6.0軟件分析流式細胞術結果。

1.4ELISA法檢測小鼠血清中各型細胞因子的水平 利用內眥靜脈取血的方法采集小鼠靜脈血約1 mL，至于無菌不含抗凝劑的Ep管中，靜置30 min，離心(3 000 rpm/min，10 min)，分離收集上層血清，分裝后置于-20 ℃冰箱內冷凍保存。小鼠血清中IFN-γ，IL-6，IL-10，TNF-α含量的檢測按照ELISA試劑盒說明說進行檢測。

2 結 果

2.1小鼠脾臟細胞表面分子CD11b檢測結果 小鼠脾臟細胞表面分子CD11b的表達均呈現中高表達的趨勢，見表1。與對照組相比(圖1)，感染組小鼠的脾臟細胞表面分子CD11b表達率顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 小鼠脾臟細胞表面分子CD11b表達率

表1 小鼠脾臟細胞表面分子CD11b表達率(%)

2.2小鼠血清中各型細胞因子水平的檢測結果 小鼠血清中不同細胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10的表達情況，見圖2。與對照組相比，感染組血清中TNF-α和IL-6的表達水平均升高(P<0.001)，IFN-γ的表達水平下降(P<0.01)，IL-10表達水平下降(P<0.01)，差異具有統計學意義。

圖2 小鼠血清中各型細胞因子的表達水平

3 討 論

目前，較為公認的慢性牙周炎致病菌為牙齦卟啉單胞菌[3]，其分泌的毒力因子例如脂多糖、菌毛素和蛋白酶等與牙周炎的發病有著密切的相關性[4]。利用Pg感染動物模型口腔中的牙周組織，構建慢性牙周炎的動物模型也得到了很多學者的證實。慢性牙周炎的發生、發展及預后，與宿主T細胞的代謝和功能有著十分密切的聯系[5-6]，通常認為宿主體內活化的CD4+T淋巴細胞可以通過產生多種不同類型的細胞因子對炎癥和牙槽骨吸收的過程進行調節，這其中，已經有學者[7]證實了宿主體內TNF-α細胞因子的水平與牙槽骨吸收密切相關，同時，也有報道證明了IL-6等細胞因子水平的高低，與成人慢性牙周炎的發病程度有明顯的相關性[8]。因此，研究動物慢性牙周炎發病過程中，體內細胞因子水平的變化，對于理解慢性牙周炎發病機制有很好的意義。

由于脾臟是體內T細胞貯存和活化過程中重要的器官，在不同生理或病理過程中，脾臟細胞中T細胞的活化水平可以在一定程度上代表體內T細胞水平的變化，因此，對脾臟細胞T細胞表面分子的研究有助于理解Pg感染小鼠后，動物體內T細胞活化水平的變化情況，也可以反映出宿主自身免疫細胞狀態，提示T細胞被致病菌誘導活化過程中的變化情況。CD11b作為骨髓來源的未分化成熟的重要表面分子[9]，是衡量體內大量由骨髓發育而來的一系列未分化成熟細胞的重要標志物，本研究中獲得的數據表明，在Pg感染的病理狀態下，動物體內的免疫器官(如脾臟)會聚集大量由骨髓發育而來的未分化成熟的T細胞；同時，CD11b作為T細胞表面分子，在細胞間的識別和信號傳導等方面也具有十分重要的作用，有研究證實了CD11b表面分子被封閉后，T細胞失去了其特有的增殖能力和免疫效應的能力，也顯示出了這一表面分子的重要作用。

同時，由于細菌感染狀態下，機體的免疫系統會分泌產生TNF-α和IL-6等促炎因子改變宿主的免疫反應，從而增加致病菌對宿主的易感性[10-11]，因此，需要對本動物模型血清中的TNF-α和IL-6細胞因子進行檢測，以確定系統免疫系統的變化情況。另一方面，TNF-α也是牙周病原體感染機體后最先誘導出的促炎因子之一，參與了牙周病的早期發展，其又可以通過刺激破骨細胞形成、誘導牙槽骨破壞和結締組織退化。IFN-γ、IL-10等細胞因子參與了造成機體牙周組織破壞的過程，因此也是慢性牙周炎發病過程中極為重要的指標[12-15]。

因此，本實驗證實了慢性牙周病動物模型血清中，各型細胞因子的表達水平差異，提示了慢性牙周炎免疫狀態及T細胞功能的變化情況；同時對脾臟細胞中T細胞表面分子CD11b的表達情況進行了研究，以期為慢性牙周炎發病機制提供更多的實驗依據。

(本文圖1見封三)