茶葉農藥殘留檢測分析方法研究進展

曹春霞 黃大野 吳瓊 胡洪濤 朱志剛 龍同 姚經武 楊丹 張光陽

摘要：論述了茶葉農藥殘留檢測的必要性以及茶葉農藥殘留檢測的前處理方法，對固相萃取（SPE）、加速溶劑萃取（ASE）、微波輔助萃取（MAE）、超臨界流體萃取（SFE）等萃取方法的原理、應用以及與傳統前處理方法相比較的優點進行了概括。也對茶葉農殘分析檢測方法進行了綜述，包括色譜法、酶聯免疫法和生物傳感器。

關鍵詞：茶葉;農藥殘留;色譜法;酶聯免疫法;生物傳感器

中圖分類號：X836? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）17-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.001? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The necessity of tea agricultural residue detection and the method of tea pretreatment were discussed. The principle， application and advantages of solid phase extraction （SPE），accelerated solvent extraction （ASE）， microwave assisted extraction of （MAE）， Supercritical fluid extraction （SFE） and other extraction methods compared with the traditional pretreatment methods were summarized.In addition， the detection methods of tea agricultural residues were reviewed， including chromatography， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and biosensors.

Key words： tea; pesticide residues; chromatography; enzyme-linked immunoassay; biosensors

中國是茶葉生產和出口大國，茶文化源遠流長、博大精深。茶葉作為一種傳統的飲品，其質量安全直接關系到消費者的健康，是否存在農藥殘留是其質量安全的重要因素，并且直接影響到茶產業的發展。隨著茶園大規模連片種植，病蟲害發生的頻率越來越高，茶農一般選擇化學農藥來防治病蟲害，存在超量、超范圍、盲目用藥、安全間隔期短等問題，而長期使用某種農藥也會導致茶葉病蟲抗藥性增強，形成惡性循環。在食品安全和環境保護方面，農藥殘留污染已成為一個非常嚴重且必須解決的問題[1]。降低茶葉農藥殘留有利于促進茶產業轉型升級和保障消費者健康。

目前，中國茶葉農藥殘留檢測主要依據農藥的種類和特性，采用有機溶劑萃取、固相萃取和凝膠色譜等進行提取凈化，并采用液相色譜或氣相色譜進行分離檢測。因為茶葉成分復雜，采用常規方法處理的提取物往往對農藥殘留的檢測干擾較大，耗時耗材，甚至導致檢測器的污染[2]。因此，必須不斷創新檢測技術，提高農藥檢測的準確性和效率。目前雖然對茶葉農藥殘留檢測的研究報道越來越多，但相關方面的綜述相對較少。本文總結了茶葉農藥殘留檢測的前處理方法和檢測技術。

1? 茶葉農藥殘留檢測的前處理方法

農藥殘留檢測包括前處理和進樣檢測，樣品的前處理是最關鍵的環節。為了前處理的高效提取，通常經過3次或多次提取，對于含水量高的樣品還需要加無水硫酸鈉，對于含糖量高的樣品則需要加入適量的水以降低糖濃度。傳統的提取方法主要有振蕩漂洗法、勻漿萃取法、索氏提取法、液-液萃取法和超聲波提取法等，但這些處理方法存在自動化程度低、溶劑消耗量大、處理時間長等缺點[3]。前處理技術發展的趨勢是研究開發凈化效果理想、時間短、工作強度低的方法，目前前處理技術已經得到了較大的發展，許多技術已經得到廣泛應用，如固相萃取（SPE）、加速溶劑萃取（ASE）、微波輔助萃取（MAE）、超臨界流體萃取（SFE）等[4]提取技術。

1.1? 固相萃取（SPE）

固相萃取（SPE）是應用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，使其與樣品的基體和干擾化合物分離，再選擇適合的洗脫液把吸附在柱中的組分洗脫下來，達到分離和凈化的目的[5]。在層析柱中加入一種或幾種吸附劑，再加入待測樣本提取液，用淋洗液洗脫，分離保留性質差別很大的化合物。李永庫等[6]應用氣相色譜法結合固相萃取分離測定了茶葉中11種農藥殘留，采用ODS-C18固相萃取柱和HLB固相萃取。ODS-C18固相萃取用乙腈作萃取劑進行兩次超聲提取，試驗結果表明ODS-C18固相萃取柱萃取效果比HLB固相萃取好。李敬霞等[7]采用固相萃取柱填料用C18鍵合相富集柱和色譜固定相HayesepQ（二乙烯基苯聚合物）自裝的小柱（100 mg）富集雌激素，也獲得了C18鍵合相富集柱回收率高的結論。由此可見，C18鍵合相富集柱比色譜固定相HayesepQ（二乙烯基苯聚合物）自裝的小柱富集效率高，因而大多數人采用C18鍵合相富集柱。乙腈極性大、穿透性強，適合多農藥殘留的提取，因此選擇乙腈作為提取劑進行萃取，是農藥殘留分析中比較通用的前處理提取劑。

1.2? 加速溶劑萃取（ASE）

加速溶劑萃取是通過提高溫度和增加壓力來加快溶解度和擴散率從而提高萃取的效率[8，9]，是近幾年較新的萃取技術，具有萃取時間短、溶劑用量少、萃取效率高等優點，是美國EPA的標準方法之一。張桃英[10]采用ASE提取法對茶葉中的六六六、滴滴涕進行提取，回收率在89.6%～108.6%，用ASE法萃取時間大幅度減少，溶劑的使用量也大大降低，提取效果比索氏提取好，萃取多個樣品時可實行自動化控制。而茶葉中含有較多的色素、生物堿及酚類化合物等脂溶性物質，在分析中造成干擾，降低分析儀器的靈敏度和使用壽命，孔維恒等[11]采用加速溶劑萃取-凝膠滲透色譜-氣相色譜質譜法測定茶葉中7種農藥殘留，回收率為79.2%～100.8%，相對標準偏差為3.15%～13.34%，該方法萃取效率高、凈化效果好、自動化程度高、精密度好，可用于茶葉農藥殘留的日常檢測。黃微等[12]采用加速溶劑萃取（ASE）-固相萃取凈化（SPE）-氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）同時測定茶葉中9種擬除蟲菊酯類農藥殘留，ASE萃取溶劑為丙酮-正己烷，檢測結果呈現較好的線性關系，背景干擾低、重現性好、靈敏度高、回收率穩定。

1.3? 微波輔助萃取（MAE）

微波輔助萃取技術是微波技術與萃取技術的結合，在樣品農藥殘留提取中，利用極性分子能迅速吸收微波能量的性質來加熱一些具有極性的溶剤，如乙醇、丙酮、乙腈等，達到萃取樣品中目標化合物和分離雜質的目的，具有高效、省溶劑（一般在20～50 mL）、快速節省時間（為傳統時間的1/6）、可同時處理多個樣品、易于自動控制等優點。顏鴻飛等[13]采用微波輔助萃取-分散固相萃取凈化-氣相色譜質譜法（GC-MS）快速檢測茶葉中23種農藥殘留量，采用乙腈對茶葉樣品進行微波輔助萃取（MAE），提取液經分散固相萃取（DSPE）凈化處理，23種農藥組分在0.01～0.50 mg/mL質量濃度范圍內呈線性關系，相關系數（R）大于0.995，加標平均回收率為70%～105%，相對標準偏差（RSD）為3.0%～8.2%，操作簡單、快速、準確、靈敏度高，能夠滿足中國出口茶葉中多種農藥殘留檢測的實際需要。蔡麗桑等[14]用普通家用變頻微波爐萃取茶葉中有機氯農藥殘留，采用氟羅里硅土柱層析凈化方法，以AN-5毛細管柱、GC-ECD的氣相色譜法進行檢測分析。該萃取方法溶劑使用量少、操作簡便快速，效果好，一個樣品在2.0～2.5 h可以完成，回收率在90%以上，可滿足茶葉中多種農藥殘留檢測的要求。傅杭英[15]建立超聲波-酶抑制法前處理分析和微波輔助萃取-酶抑制法檢測前處理分析方法，對兩種樣品前處理技術進行對比研究，結果表明，在相同條件下對茶葉樣品中的農藥殘留進行提取，乙酸乙酯的提取效果最好，提取的樣品溶液顏色較淺，回收率最高，以氧化樂果為例，乙腈、乙酸乙酯、丙酮三種溶劑的回收率分別為81.50%、89.21%、79.93%。此外乙酸乙酯的毒性低于乙腈和丙酮，綜合考慮，最終選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

1.4? 超臨界流體萃取（SFE）

中國對于超臨界流體萃取技術的研究較其他的的樣品前處理技術來說發展較早，是目前應用較為廣泛的一項樣品前處理技術。該技術以超臨界流體作為流動相，在高于臨界溫度和臨界壓力的條件下，根據相似相溶原理，利用超臨界流體的特性，從樣品中萃取目標物。主要特點是快速、選擇性強，不使用有機溶劑，不污染樣品和環境，可以與色譜儀器聯用，避免樣品轉移損失，減少人為誤差，提高了方法的靈敏度和精密度，但該技術對設備和技術人員的操作均有較高的要求。邱月明等[16]用超臨界流體萃取（SFE）進行樣品前處理，用吸附小柱進行富集和凈化，氣相色譜-電子捕獲檢測器測定茶葉中17種有機氯農藥殘留的方法，該法與傳統方法有相近的精密度，而分析周期小于2 h，證明此法是一種快速準確的測定茶葉中有機氯農藥的方法。

2? 茶葉農藥殘留檢測技術

茶葉農殘檢測的方法包括色譜法、酶聯免疫法、生物傳感器。色譜法又稱色譜分析、色譜分析法、層析法，是一種分離和分析方法，在分析化學、生物化學、有機化學等領域有著廣泛的應用。色譜法應用不同物質在不同相態的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質會以不同的速度沿固定相移動，從而達到分離的效果。酶聯免疫法是指利用抗體與抗原特異性結合的特點，將酶與相應的抗原或抗體結合，酶結合物與相應的抗原或抗體結合后，能通過加入底物的顏色反應來檢測免疫反應。生物傳感器是一種對生物物質敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器，具有接受器與轉換器的功能，是由固定化的生物敏感材料作識別元件（如微生物、酶、抗體、抗原、細胞等生物活性物質）、適當的理化換能器（如光敏管、氧電極、場效應管等）以及信號放大裝置構成的分析工具或系統[17]。

2.1? 色譜法

高效液相色譜法與經典的液相色譜法相比具有明顯的優勢。色譜柱提高了分離效能;高壓泵的使用提高了流動相的流速及穩定性;高靈敏度的檢測器提高了檢測靈敏度;不受試樣揮發性和熱穩定性影響，可用于分離相對分子質量大、離子型化合物，尤其適用于分析沸點高、熱不穩定、不易氣化、非揮發性農藥的檢測。另外與氣相色譜法相比，高效液相色譜法的流動相為液體，其組分、配比、pH參與調節待測物在色譜柱內的液固分配機制，更有益于樣品的分離分析[18]。陸小磊等[19]采用超高效液相色譜-串聯質譜測定茶葉中氯噻啉殘留量，用乙腈提取樣品，然后經GC-e/NH 2柱去除雜質，經C18液相柱分離后，用電噴霧離子化-串聯質譜測定，在12.5～100.0 μg/L質量濃度范圍內，氯噻啉工作曲線相關系數（R）為0.994 5，儀器最小檢出量為5.98×10-13 g。茶葉中氯噻啉回收率在94.66%～96.30%，相對標準偏差（RSD）小于8.0%，最低檢出限為0.99×10-3 mg/kg。該方法準確、快速、穩定，能夠滿足實際殘留檢測的需要。

2.2? 酶聯免疫法

色譜法因具有準確、高效、靈敏等特點而應用較廣，但由于樣品前處理復雜，且對設備和技術要求較高，不適用于大范圍的快速篩選。而免疫分析方法在特異性、靈敏度、操作步驟和材料價格上具有明顯的優勢，適用于快速篩選及檢測，已漸漸成為一種重要的農藥殘留檢測技術[20]。當前用于農藥殘留分析的免疫分析方法主要有4種，包括酶聯免疫吸附分析（EIA/ELISA）、放射免疫分析（RIA）、熒光免疫分析（FIA/PFIA）、化學發光免疫分析（CLIA）。其中，EIA/ELISA是較常用的農藥殘留檢測方法，是將免疫技術和現代化測試技術進行融合后產生的新型技術形式，涉及到多個學科知識的綜合應用，為農藥殘留檢測技術的發展創新提供了更加廣闊的思路[21]。方松等[22]建立了基于多克隆抗體的氯噻啉間接競爭酶聯免疫分析（ic-ELISA）方法。設計合成了氯噻啉半抗原，并分別與牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶聯制備免疫原和包被原。用免疫原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，抗體效價為2.56×106。對離子強度、有機溶劑含量和pH等影響因素進行優化，確定了氯噻啉ic-ELISA的最佳檢測條件，并建立了氯噻啉標準競爭曲線，該方法的抑制中濃度（IC50）為0.18 mg/L，最低檢測限（IC10）為0.001 8 mg/L，在水、土壤和甘藍中分別添加0.05～1.00 mg/kg 的氯噻啉標準溶液，平均回收率為91.42%～113.82%，相對標準偏差（RSD）為0.72%～8.68%，符合農藥殘留檢測要求。由于食品中較多情況下存在多種農藥殘留，單農藥組分免疫分析方法及檢測試劑盒很難滿足實際需要。因此，開發具有寬譜特異性的抗體來制備多殘留檢測試劑盒更能適應科學研究和市場需求。

2.3? 生物傳感器

生物體成分（抗原、抗體、酶、激素、DNA）或生物體本身（組織、細胞、細胞器）能特異地識別被測物質并與之反應;后者主要有電化學電極、離子敏場效應晶體管（ISFET）、熱敏電阻器、光纖、光電管等，其功能是將敏感元件感知的生物化學信號轉變為可測量的電信號。根據生物活性物質不同，生物傳感器可分為酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器等。農藥殘留檢測領域中應用最廣泛的是酶傳感器和微生物傳感器。

酶傳感器是將酶經過某種方式與固相載體結合，并將其裝在一個小柱子中成為固定化反應柱，或將酶固定在電極上采用電化學的方式傳導酶反應產物的信息。按照反應原理和敏感材料可分為酶抑制生物傳感器、酶聯免疫生物傳感器、酶降解生物傳感器等，其中酶抑制生物傳感器在農藥殘留檢測中研究較為廣泛。目前結合電學或光學轉換器形成一系列的電化學、光化學酶抑制生物傳感器，實現了蔬菜、水果、土壤和水中的有機磷、氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測。梁東軍等[23]應用自組裝法制備了多層乙酰膽堿酯酶/殼聚糖/碳納米管（AChE/CS/FCNTs/GCE）生物傳感器，該傳感器對氨基甲酸酯類農藥具有較好的響應，如2-（1-甲基乙基）苯基甲基氨基甲酸酯在2.00×10-9～2.00×10-7 g/L內呈現良好的線性關系，檢出限為5.41×10-9 g/L。干寧等[24]將乙酸膽堿酯酶（AChE）及膽堿氧化酶（ChOx）同時固定在絲網印刷電極表面的Fe3O4/Au納米復合微粒上， 構建了一種新型快速測定有機磷和氨基甲酸酯類農藥的雙酶傳感器，該傳感器對克百威和敵敵畏的檢測范圍在0.05～1.00 μg/mL，成本較低、制備簡單，適用于氨基甲酸酯和有機磷類農藥現場大規模篩測。

微生物傳感器的檢測原理分為兩種：一種是利用微生物在同化底物時消耗氧的呼吸作用;另一種是利用不同微生物含有的酶不同，這和動植物組織一樣，把它作為酶源。在微生物數量和活性不變的情況下，根據其消耗的溶解氧量或產生的電活性物質的量來反映檢測物質的量，然后借助氣體敏感膜電極（如二氧化碳電極、溶解氧電極、氨電極等）或離子選擇電極（如pH玻璃電極）來檢測溶解氧和電活性物質的變化，即可求出待測物質的量。袁東星等[25]研究了一種快速檢測蔬菜中有機磷農藥殘留的方法，采用一種發光細菌與鹽溶液相結合，從蔬菜中洗滌出殘留的農藥，加入定量發光菌溶液，通過觀察發光量的變化來檢測農藥含量。結果表明，此方法可檢測蔬菜中有機磷農藥殘留，成本低廉且快速有效。

3? 展望

當前，茶葉農藥殘留檢測的前處理技術朝著更方便、更高效、檢測成分多元化等方向發展。隨著檢測技術和設備的發展，樣品的提取技術也會相應進步。檢測技術向樣品與試劑微量化、高靈敏度、高精準度、前處理與檢測一體化的趨勢發展。

茶葉產業是目前精準扶貧和農業供給側改革的重要抓手，加強茶葉質量安全管理對提高中國茶葉產業的生產水平，增強中國茶葉產品的國際競爭力具有十分重要的戰略意義。

輸歐茶葉因其利潤高，受到國內出口茶企的青睞和重視，已成為出口轉型升級的主攻方向之一。隨著農業部實施“兩減行動”和“十三五”重點研發計劃，中國茶葉種植基地對化學農藥的使用有著較高的認識，逐漸采用生物農藥替代化學農藥，達到從源頭控制農殘的目的。但是當前農藥生產流通環節仍然比較混亂，一藥多名、一名多藥的現象普遍存在，一些茶葉種植過程禁用的農藥如氰戊菊酯、三氯殺螨醇、氟蟲腈等在農藥流通市場仍可采購或混配在其他農藥產品中，還有部分產品打著生物農藥的名頭卻添加化學農藥等隱性成分，造成農藥殘留超標，這些都給茶葉農藥殘留問題留下了極大隱患。

近幾年，歐盟對中國輸歐茶葉農藥殘留檢測要求日趨嚴格，口岸管控措施也日漸加嚴，使得出口歐盟茶葉面臨極其嚴峻的形勢。科研機構應當加快低毒、環境友好型病蟲害防控新技術的研發，結合預測預報，推廣化學農藥、生物農藥的配套使用等技術措施。地方政府應嚴格控制農藥的使用特別是禁用高毒農藥，加強流通環節農藥質量監管，建立涉茶農藥檔案，保障茶葉質量安全。

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收稿日期：2019-04-19

基金項目：湖北省技術創新專項（2017ABA160）;湖北省農業科技創新中心創新團隊項目（2016-620-000-001-038）

作者簡介：曹春霞（1975-），女，湖北武漢人，研究員，主要從事生物農藥劑型與應用技術研究及生物農藥示范推廣，（電話）13971093916