馬流感H3N8實時熒光RT-PCR檢測方法的建立

林志雄 魚海瓊 王瑩 翟建新 張利

摘要：通過比對NCBI上馬流感H3N8序列，針對HA和NA基因序列高度保守區域設計了特異性強的引物與探針，優化了程序，建立了以實時熒光RT-PCR技術檢測馬流感H3N8的方法。結果表明，該方法最小檢測濃度為3.36×102 copies/μL;特異性強，僅針對馬流感H3N8樣本檢出為陽性;對58份臨床樣本的檢測，陽性檢出率為12.07%，是常規PCR的2.3倍，且與病毒分離100%符合。

關鍵詞：馬流感病毒;H3N8亞型;實時熒光RT-PCR

中圖分類號：Q789;S852.65? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）17-0129-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.034? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： By comparing the H3N8 sequence of Equine influenza virus （EIV） from NCBI， highly specific primers and probes were designed for the highly conserved region of HA and NA gene sequences， and the program was optimized to establish a RT-PCR method for the detection of EIV H3N8. The results showed that the minimum detection concentration was 3.36×102 copies/μL. With high specificity， only EIV H3N8 samples were positive. The positive detection rate of 58 clinical samples was 12.07%， 2.3 times that of conventional PCR， and 100% consistent with virus isolation.

Key words： Equine influenza virus（EIV）; H3N8 subtype; RT-PCR

馬流感病毒（Equine influenza virus，EIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，其基因組由8股負鏈RNA構成，包括神經氨酸酶（HA）基因、血凝素（NA）基因、核蛋白（NP）基因、基質蛋白（M）基因、聚合酶堿性蛋白1（PB1）基因、聚合酶堿性蛋白2（PB2）基因、聚合酶酸性蛋白（PA）基因和非結構蛋白（NS）基因[1]，其中HA基因與NA基因在流感中變異最為頻繁，亞型眾多。到目前為止，馬流感僅有H7N7和H3N8兩種亞型[1]。

H3N8亞型流感是馬屬動物呼吸道疫病的主要原因，發病率高，致死率較低，但常造成較大的經濟損失，馬流感亦極有可能與其他流感發生重組。目前臨床上檢測馬流感的方法較多，有病毒分離、血凝抑制試驗，基于血清學的ELISA，也有基于核酸檢測的核酸擴增技術，相比之下核酸擴增的效率更高，實時熒光定量的方法由于綜合性能強，檢測速度快，靈敏度高，操作簡單，使用便利，并已得到大量廣泛的使用[2]。為此，本研究針對馬流感H3N8 HA和NA基因序列高度保守區域設計了特異性強的引物與探針，擬建立以實時熒光RT-PCR技術檢測馬流感H3N8的方法，以期為后續產品商品化提供理論和研究基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

禽流感H5N1、H5N6、H7N9各5份，人流感H3N2、 H1N1各5份，馬流感H3N8 5份，臨床采集到馬鼻咽喉拭子共58份。由于試驗所用的病毒株涉及保存條件要求和樣本信息保密性，故病毒株測試試驗主要在廣東省疾病預防控制中心和深圳市疾病預防控制中心實驗室完成;臨床樣本測試試驗在深圳市疾病預防控制中心實驗室完成。

儀器和試劑：7500型熒光PCR儀購自ABI公司，探針引物由Takara合成，pMD 18-T載體購自Takara，熒光PCR試劑購自美國VitaNavi公司。

1.2? 方法

1.2.1? 引物設計? 從NCBI上下載馬源宿主H3N8亞型流感HA和NA基因序列，分離地點包括中國、日本、中國香港、印度等地。應用Lasergene軟件分別比對HA和NA基因序列的保守區域和SNP特性，使用在線網站weblogo3對引物及探針進行特殊結構分析，NCBI BLAST進行比對最終確定引物及探針。所設計出的H3N8引物探針特異性檢測馬流感H3N8亞型，而對其他亞型無檢出。本研究中所確定的馬流感H3N8引物探針序列信息見表1。

1.2.2? 陽性質粒制備? 通過比對馬流感H3N8序列，選擇含有HA和NA基因序列區域合成質粒片段，并將該片段與pMD 18-T載體相連接轉化至工程菌大腸桿菌DH5α中，通過氨芐藍白斑篩選轉化成功的大腸桿菌，通過PCR以及酶切測序鑒定目的片段，合格后抽提質粒制備陽性對照。

1.2.3? 熒光PCR擴增? 反應體系為25 μL，包括2×Omnitaq PCR buffer 12.5 μL，35 mmol/L dUTPs 0.5 μL，Enzyme Combo LA 2 μL，Cesium Taq LA DNA Polymerase 1 μL，H3上游 primer（400 nmol/L） 0.1 μL，H3下游primer（400 nmol/L） 0.1 μL，N8上游primer（400 nmol/L） 0.1 μL，N8下游primer（400 nmol/L）0.1 μL，核酸5 μL和ddH2O 3.6 μL。