腺嘌呤殼聚糖納米粒的制備及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響

郁曉萌 譚旭鑫 楊可 王琪 張堃 梁恩俊 朱逸麟 于文靜

（1 濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 山東 濰坊 261053）

（2 濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系 山東 濰坊 261053）

殼聚糖(Chitosan，CS)作為一種天然高分子材料，具有良好的生物活性和自然降解性，可以作為理想的抗腫瘤藥物靶向制劑的載體材料。腺嘌呤(adenine，Ade)是核酸的組成成分并參與遺傳物質(zhì)的合成，它能促進(jìn)白細(xì)胞增生，用于防治各種原因引起的白細(xì)胞減少癥，特別是用于腫瘤化學(xué)治療。但是腺嘌呤不溶于水，在體內(nèi)代謝非常迅速，不適合口服和注射。因此在該實(shí)驗(yàn)中將其載進(jìn)殼聚糖內(nèi)，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，蓄積于靶部位，提高藥物治療效果。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Malvern Zetasizer Nano ZS 90激光粒度儀，英國(guó)Malvern公司；JEM1400透射電子顯微鏡，日本Jeol公司；

超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；CHRIST凍干機(jī)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；TU-1810紫外/可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JHT-SSC型超凈工作臺(tái)，濟(jì)南康寶凈化設(shè)備有限責(zé)任公司；HH、CP-TW型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；NIB-100型倒置顯微鏡，寧波永新光學(xué)股份有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；透析袋MD44（3500D），Solarbio公司，貨號(hào)YA1078。

殼聚糖（粘度70mPa·S，分子量90000）；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清，DMSO, 均購(gòu)自Solarbio公司；MTT，sigma；36%乙酸，三聚磷酸鈉（TPP），1mol/L NaOH溶液，EDTA,碳酸氫鈉試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 納米粒的制備 稀釋36%醋酸溶液到1%并溶解殼聚糖制備2.5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，用蒸餾水溶解三聚磷酸鈉制備5mg/ml,6mg/ml,7mg/ml,8mg/ml的三聚磷酸鈉溶液，取殼聚糖醋酸溶液20ml于單口燒瓶中，用1mol/l的NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系PH=5.5。25℃，500r/min磁力攪拌下緩慢（約2s每滴）分別滴加不同濃度的三聚磷酸鈉溶液至剛產(chǎn)生乳光，繼續(xù)磁力攪拌10min，得到殼聚糖空白納米粒。

1.2.2 粒徑分布及Zeta電位的測(cè)量 取適量殼聚糖空白納米粒懸液，蒸餾水稀釋10倍，超聲10min，用zeta電位及粒度分析儀測(cè)定其納米粒粒徑、多分散指數(shù)（PDI）和Zeta電位的大小。

1.2.3 腺嘌呤聯(lián)合殼聚糖納米粒的制備 分別稱取5mg,10mg的腺嘌呤（Ade）溶解于1ml的1,2-丙二醇溶液中，封口膜封口，超聲約2h，直至溶液澄清透明。分別取5ml的TPP=5，6，7，8mg/ml的殼聚糖空白納米粒加入上述溶液中。水浴磁力攪拌器（室溫下）中攪拌過(guò)夜（或24h）。

1.2.4 粒徑分布及Zeta電位的測(cè)量 方法同上1.2.2。

1.2.5 包封率和載藥量的測(cè)定 透析10h以上，-80℃凍干，稱取少量?jī)龈煞郏?%的醋酸溶液溶解并稀釋至10ml，然后在掃描波長(zhǎng)處測(cè)定紫外吸光度。

包封率＝［（藥物總量- 介質(zhì)中未包入的藥量）/藥物總量］×100%。

載藥量＝（微粒中含藥量/微粒的總重量）×100%。

1.2.6 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系HepG2，細(xì)胞形態(tài)是貼壁上皮細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清），在37℃、5% CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.7 MTT法檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以2000個(gè)/孔鋪96孔板，每次3板，待過(guò)夜細(xì)胞呫壁后棄掉上清，以RPMI-1640培養(yǎng)基配置載藥納米粒，終濃度分別0.1ug/mL、1ug/mL、2.5ug/mL、5ug/mL、10ug/mL，每孔200uL，每組5個(gè)復(fù)孔，設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔。分別于24h、48h、72h終止培養(yǎng)，避光添加MTT，4h后150uLDMSO溶解結(jié)晶，于540nm讀取OD值。

2.結(jié)果與討論

2.1 納米粒的制備和形態(tài)考察

本實(shí)驗(yàn)采用離子凝集法制備載腺嘌呤殼聚糖納米粒，主要以粒徑及包封率為表征參數(shù)，考察制備過(guò)程中各種因素對(duì)納米粒形成的影響。當(dāng)Ade=5mg/ml、TPP=8mg/ml，反應(yīng)體系PH=5.5，溫度為25℃，轉(zhuǎn)數(shù)500r/min時(shí)，所制得的納米粒最優(yōu)化。

2.2 空白納米粒參數(shù)

2.2.1 zeta電位 測(cè)得平均電位為24.8。

2.2.2 粒徑 平均粒徑為160.7nm，PDI=0.301。

2.3 載腺嘌呤殼聚糖納米粒參數(shù)

2.3.1 粒徑 測(cè)得載藥納米粒粒徑為177.6nm，PDI=0.242。結(jié)果如圖1。

圖1 載藥納米粒粒徑圖

2.3.2 zeta電位 測(cè)得載藥納米粒的電位為27.4。說(shuō)明納米粒液穩(wěn)定。

2.4 包封率和載藥量的測(cè)定

根據(jù)紫外/可見光光度法測(cè)定的Ade標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=10.474 x- 0.0082，R2=0.9996 ）得出，Ade在納米粒中的載藥量為（43.2±5.4）%；根據(jù)高效液相色譜法測(cè)定的Ade標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=110.38 x- 0.8672，R2=0.9999 ），得出Ade在納米粒中的包封率為（85.7±0.58）%。

圖2 Ade標(biāo)準(zhǔn)曲線（HPLC)

2.5 腺嘌呤殼聚糖納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

藥物濃度10ug/mL，72h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 =（A對(duì)照-A加藥）/A對(duì)照×100%=（1.273～1.026）/1.273×100%=19.4%。

圖3 腺嘌呤殼聚糖納米粒對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

3.結(jié)論

通過(guò)離子凝集法制備殼聚糖空白納米粒，測(cè)定其粒徑分布及zeta電位，并在此基礎(chǔ)上，以腺嘌呤作為藥物模型，殼聚糖作為載體，三聚磷酸鈉為陰離子，利用陰陽(yáng)離子間的靜電相互作用，成功制備了殼聚糖載腺嘌呤納米粒。在殼聚糖空白納米粒制作過(guò)程中，殼聚糖和TPP的濃度、溫度、攪拌速率等對(duì)粒徑大小產(chǎn)生一定的影響，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得出在Ade=5mg/ml，TPP=8mg/ml，反應(yīng)體系PH=5.5，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速500r/min時(shí)，制備的殼聚糖載腺嘌呤納米粒最佳，納米粒粒徑約為177.6nm，粒徑較小，分散均一，Zeta電位為27.4mV，載藥納米粒穩(wěn)定。腺嘌呤殼聚糖納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有一定的抑制作用。