產地對燕麥種帶真菌的影響

聶秀美，趙桂琴，蘭曉君，柴繼寬，劉 歡，金小雯，吳文斌, 藺豆豆

(甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070)

燕麥(Avenasativa)是禾本科(Gramineae)燕麥屬(Avena)一年生糧飼兼用作物，主要分布在我國內蒙古、河北、甘肅和山西等地[1]。燕麥種子中淀粉、蛋白質、脂肪等營養物質含量都比較高，是家畜的優質精飼料[2-3]，還富含可溶性膳食纖維、維生素、亞油酸、葡聚糖等多種營養成分，具有調節血脂、延緩衰老、降低膽固醇以及促進傷口愈合等功效，具有較高的保健價值[4-5]。

作為植物的繁殖器官和農牧業生產的基礎資料，種子健康是提高作物產量和品質的前提，也是種質安全保存的首要條件[6]，但田間收獲貯藏的種子通常攜帶大量的真菌，這些真菌吸附于種子表面或侵入組織內部，是許多病害的初侵染源，是病害遠距離傳播的主要媒介和攜帶者[7]。種子帶菌不僅會影響種子的萌發、幼苗的健康生長，還會降低種子品質、縮短種子壽命，最終導致作物質量和產量降低，造成經濟損失[8]。此外，種子在貯藏過程中某些產毒病原真菌還會分泌真菌毒素，嚴重影響產品安全，對人畜健康造成極大威脅[9-10]。

近年來，隨著我國草產業的發展，燕麥的種植面積不斷擴大，種子的需求量逐漸增加，異地調種日益頻繁，增大了病原菌傳播的風險。燕麥種帶真菌是病害在時間和空間上傳播的主要途徑之一，也是其種子安全保存的重大隱患之一。目前，我國對種帶真菌的研究主要集中在水稻(Oryzasativa)[11-12]、玉米(Zeamay)[13]、小麥(Triticumaestivum)[14-15]等經濟作物方面，對燕麥種子帶菌情況的報道較少，僅見荊卓瓊等[16]采用平板培養法對甘肅省4個燕麥種子樣本的種帶真菌進行檢測，依據真菌形態特征鑒定出19個屬，其中鏈格孢屬(Alternariasp.)為優勢菌，檢出率達38%～98%；馬從[17]通過平板培養法和形態學鑒定從燕麥種子中分離鑒定出6屬21種真菌，主要為青霉菌屬(Penicilliumsp.)和鐮刀菌屬(Fusariumsp.)。由于不同生產區域的環境因子(主要是氣候條件和栽培制度)不同，因此，真菌種類和數量有很大差異，種子帶菌情況也會隨之變化。如劉志勇[18]對黑龍江省10個不同地區大豆(Glycinemax)品種的帶菌情況進行研究表明，不同地區大豆品種間的帶菌率為2%～26%，且不同地區的優勢菌和分離率差異較大。高晨軒[19]表明垂穗披堿草(Elymusnutans)種子的帶菌率和種帶真菌的多樣性與環境因子(主要是海拔、年均氣溫、年降雨量和經緯度等)相關性較大，優勢屬為鐮刀菌屬和鏈格孢屬，在各采樣點均檢出，分離率較高；其它屬為常見屬或稀有屬，分離率較低。而目前有關產地對燕麥種子種帶真菌影響方面還未見報道。因此，本研究擬對我國河北省張北縣張北鎮和甘肅省通渭縣華家嶺鎮兩大燕麥主栽培區的相同燕麥品種的種帶真菌進行分離和鑒定，旨在明確其攜帶真菌所屬種類以及產地對燕麥種子帶菌情況的影響，為燕麥種子的健康保存提供理論依據，為燕麥種傳病害的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年10月在甘肅農業大學草業學院實驗室進行，供試材料為2015年9月在甘肅省通渭縣華家嶺鎮和河北省張北縣張北鎮收獲后保存于當地燕麥種子庫的裸燕麥‘壩莜3號’和‘壩莜9號’，種子貯藏期間的概況見表1。

表1 供試燕麥種子及其產地概況

1.2 種帶真菌的分離培養

每份種子樣品隨機取200粒種子，其中100粒等距離放置于90 mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA) 培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL，含硫酸鏈霉素、卡那霉素各100 mg·L-1)上，每皿5粒，5皿為1重復，共4次重復，置于25℃恒溫培養箱中暗培養。另100粒種子經75%酒精浸泡消毒1 min，再用1%次氯酸鈉消毒2 min，用無菌水充分洗滌3～5次，用滅菌濾紙吸干種子表面的水分后按上述條件培養。每天進行觀察，及時挑取菌絲至新鮮PDA培養基上分離純化。待不再有新的菌落出現時，統計帶菌種子數和帶某種真菌種子數，并參照徐秀蘭等[20]的方法計算種子帶菌率和某菌分離率：

帶菌率(%)=(帶菌種子數/檢測種子總數)×100；

某菌分離率(%)=(帶某種菌的種子數/帶菌種子總數)×100。

1.3 種帶真菌的形態鑒定

將純化后的真菌在新鮮PDA平板上25℃黑暗培養7 d后，參照《植物病原真菌學》[21]和《真菌分類學》[22]，在顯微鏡下觀察菌落和分生孢子的形狀、顏色和大小等形態學特征進行初步鑒定。

1.4 種帶真菌的分子生物學鑒定

1.4.1種帶真菌的DNA提取 分離純化的真菌在PDA培養基上培養7 d左右，采用真菌基因組Omega試劑盒提取菌株DNA。具體步驟為：取約0.1 g新鮮菌絲加入液氮充分碾磨后迅速轉移到2 mL離心管中，并立即加入500 μL裂解液CPL和10 μL 2-巰基乙醇，經渦旋振蕩混勻后65℃下水浴15 min；加入500 μL氯仿/異戊醇(24∶1)充分混勻后在12000 r·min-1下離心5 min；取上清液300 μL于新的離心管中，加入150 μL洗脫緩沖液CXD和300 μL無水乙醇，混勻后轉入帶有吸附柱的收集管中，在12000 r·min-1下離心1 min，棄廢液；向吸附柱中加入650 μL漂洗液SPW于12 000 r·min-1離心1 min，棄廢液；重復上次步驟后于1 2000 r·min-1離心2 min，棄廢液；將吸附柱置于新的離心管中室溫靜置10 min至晾干；向吸附柱中間部位懸空滴加70 μL洗脫緩沖液Elution buffer，室溫靜置5 min后于12 000 r·min-1下離心2 min，收集到的提取液于—20℃保存備用。

1.4.2種帶真菌的PCR擴增和測序 利用真菌特異性引物對ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行擴增，其中PCR反應體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix溶液25 μL，10 μmol· L-1引物各1 μL，模板5 μL，補充ddH2O至50 μL。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環；72℃下延伸7 min。反應完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，點樣5 μL，用1×TAE電泳緩沖液在100 V的電場下電泳20 min左右，利用紫外凝膠成像儀觀察照相并分析，擴增產物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序。

1.4.3種帶真菌的序列分析和系統發育樹構建 測序結果經DNASTAR軟件包中的SeqMan進行校對拼接，BioEdit軟件對每個堿基進行人工校對后，登錄NCBI數據庫進行Blast同源序列比對，并用Mega 7.0軟件中的鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構建系統發育樹，進行1000次重抽樣計算系統樹中節點的置信度。

2 結果與分析

2.1 產地對燕麥種子帶菌率的影響

通過對來自甘肅省通渭縣華家嶺鎮和河北省張北縣張北鎮的燕麥種子進行真菌培養后發現，兩地供試種樣的帶菌率存在明顯差異(表2)。不經表面消毒的樣品帶菌率為85%～100%，甘肅華家嶺的樣品帶菌率相對較高，平均為98.50%；河北張北鎮的平均帶菌率為87.50%，兩者相差11%。經表面消毒的種子帶菌率為7%～19%，其中甘肅華家嶺的平均帶菌率為16%，河北張北的為8%。另外，品種間差異也比較明顯，甘肅華家嶺的‘壩莜3號’消毒前后的帶菌率分別為97%和13%；河北張北的‘壩莜3號’消毒前帶菌率為85%，消毒后僅為7%。‘壩莜9號’在甘肅華家嶺消毒前帶菌率高達100%，消毒后為19%；在河北張北消毒前后帶菌率分別為90%和9%。

2.2 燕麥種帶真菌的形態學觀察

分離純化的種帶真菌在PDA培養基培養7 d后，觀察和描述菌落形態和分生孢子形態特征，部分菌落和孢子形態如圖1所示。

表2 供試燕麥材料的帶菌率

蕓薹鏈格孢(Alternariabrassicae，圖1 A～C)菌落生長速度較快，稍隆起，近似圓形，直徑約61 mm，表面絨狀，中間顏色較深，呈深褐色，邊緣整齊，呈淺褐色，具白色氣生菌絲，生長稀疏，背面具有同心圓，中間黑褐色，邊緣黃褐色。分生孢子單生，倒梨形或倒棒狀，黃褐色，大小為(13.31～24.53)μm ×(3.43～10.65)μm，具橫膈膜3～10個，縱斜隔膜0～5個。

蘆竹節菱孢(Arthriniumarundinis，圖1 D～F)菌落生長快速，平鋪，圓形，直徑約90 mm，表面絨毛狀或棉絮狀，呈白色，邊緣整齊，氣生菌絲濃密，背面白色。分生孢子單生或串生，球形或橢球形，黑褐色，大小為1.12～2.58 μm，無隔膜。

塔兵曲霉(Aspergillustubingensis，圖1 G～I)菌落生長速度較快，平鋪，近似圓形，直徑約65 mm，表面粉狀，邊緣整齊，整體呈黑褐色，邊緣具白色氣生菌絲，生長稀疏，有放射狀紋理，背面米白色。分生孢子球形，黃褐色至黑褐色，大小為2.37～3.24 μm，無隔膜。

湯姆青霉(Penicilliumthomii，圖1 J～L)菌落生長速度緩慢，均勻隆起，近似圓形，直徑約32 mm，表面粉狀，藍綠色，可泌出無色水滴，邊緣整齊，背面米白色。分生孢子球形，黃綠色或淺綠色，大小為2.42～3.02 μm，無隔膜。

2.3 燕麥種帶真菌的分子生物學鑒定

采用真菌rDNA通用擴增引物ITS1和ITS4，對從燕麥種子分離獲得的具有形態差異的代表性菌株的DNA進行PCR擴增，從擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜(圖2)中可看到擴增條帶清晰明亮、無拖尾和雜帶現象，各真菌擴增出的目的片段長度在500～750 bp，整體擴增效果良好，符合測序要求。將測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對表明，各被鑒定菌株與其對應的比對菌株相似度均在98%以上。進一步通過Clustal W軟件進行堿基序列比對，并通過Mega 7.0軟件以鄰接法構建系統發育樹，如圖3所示，不同種的菌株位于不同的分支末端，單獨形成一支；除鏈格孢屬的細極鏈格孢(Alternariatenuissima)和鏈格二孢(Alternariarosae)未能與其它鏈格孢屬的菌株明顯聚為一支，其它同一個屬的菌株都聚在一個較大的分支。這些菌株被鑒定為13屬30種，其中鏈格孢屬8種，青霉菌屬6種，節凌孢屬(Arthriniumsp.)2種，曲霉菌屬(Aspergillussp.)3種，枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)3種，德氏霉屬(Drechslerasp.)2種，附球菌屬(Epicoccumsp.)、根霉屬(Rhizopussp.)、毛霉屬(Mucorsp.)、棒囊殼菌屬(Corynascussp.)、鐮刀菌屬和色串孢屬(Torulasp.)各1種。

圖2 PCR擴增產物的電泳檢測結果

2.4 產地對燕麥種子帶菌種類和分離率的影響

不同來源的種子樣本所帶真菌的種類和分離率差異較大(表3)，分離率介于0.15%～59.85%之間。從甘肅華家嶺和河北張北的種子樣本中分別檢測到11屬22種和11屬23種真菌，其中蔥鏈格孢菌(Alternariaporri，分離率8.05%)、蘆竹節菱孢(分離率4.02%)、凍土毛霉(Mucorhiemalis，分離率4.02%)、離生青霉(Penicilliumsolitum，分離率3.76%)、黑曲霉(Aspergillusniger，分離率1.15%)、多孢枝孢(Cladosporiumpseudocladosporioides，分離率0.75%)和枝孢菌(Cladosporiummichoacanense，分離率0.15%)7種真菌僅在甘肅華家嶺燕麥樣本中檢出。赤曲霉(Aspergillusruber，分離率11.11%)、鏈格孢菌(Alternariaslovaca，分離率6.06%)、藜生鏈格孢(Alternariachenopodiicola，分離率5.26%)、橘灰青霉(Penicillumaurantiogriseum，分離率3.97%)、棒囊殼菌(Corynascusverrucosus，分離率3.03%)、鏈格二孢(Alternariarosae，分離率1.59%)和昏暗色串孢(Torulacaligans，分離率0.79%)7種真菌僅在河北張北燕麥種子中檢出。兩個產地均能分離到的真菌有細交鏈孢(Alternariaalternate)、蕓薹鏈格孢、細極鏈格孢、蘋果鏈格孢(Alternariamali)、塔賓曲霉、芽枝狀枝孢(Cladosporiumcladosporioides)、燕麥內臍蠕孢(Drechsleraavenae)、黑附球菌(Epicoccumnigum)、梨孢鐮刀菌(Fusariumpoae)、燕麥核腔菌(Pyrenophoraavenae)、金青霉(Penicilliumaurantiocandidum)、產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、波蘭青霉(Penicilliumpolonicum)、湯姆青霉和米根霉(Rhizopusoryzae)，其中甘肅華家嶺樣品中細交鏈孢的平均分離率最大，為40.05%；其次是芽枝狀枝孢(分離率21.36%)；枝孢菌的平均分離率最小，僅有0.04%。河北張北樣品中細交鏈孢的平均分離率也最高，為37.11%；其次是產黃青霉，分離率為13.45%；波蘭青霉的分離率最低為0.19%。

圖3 基于rDNA-ITS序列構建的燕麥種帶真菌系統發育樹

另外，不經表面消毒的樣品所攜帶的真菌共有12屬28種，分離率為0.15%～59.85%。其中細交鏈孢的平均分離率最大，為53.73%；其次是黑附球菌(分離率8.73%)、蕓薹鏈格孢菌(分離率7.54%)和芽枝狀枝孢(分離率5.09%)。與未經表面消毒的材料相比，消毒處理后真菌的種類和分離率存在明顯差異，共檢測出8屬12種，分離率為5.26%～38.46%，4份樣品中共同攜帶的真菌只有細交鏈孢，分離率最高為38.46%。經表面消毒的種子攜帶的真菌除節菱孢菌(Arthriniumrasikravindrae，分離率15.79%)和藜生鏈格孢(分離率5.26%)外，均可以在未消毒種子上檢測到；而赤曲霉(分離率11.11%)、蔥鏈格孢菌(分離率8.05%)、鏈格孢菌(分離率6.06%)、蘆竹節菱孢(分離率4.02%)、凍土毛霉(分離率4.02%)、橘灰青霉(分離率3.97%)、離生青霉(分離率3.76%)、鏈格二孢(分離率1.59%)、黑曲霉(分離率1.15%)、昏暗色串孢(分離率0.79%)、多孢枝孢(分離率0.75%)和枝孢菌(分離率0.15%)僅存在于未消毒的種子中。

表3 燕麥種帶真菌種類和分離率

注：B3G,B9G分別表示甘肅華家嶺的‘壩莜3號’、‘壩莜9號’，B3H、B9H分別表示河北張北的‘壩莜3號’、‘壩莜9號’

Note:B3G and B9G represent ‘Bayou No.3’ and ‘Bayou No.9’ from Huajialing Town of Gansu Province,B3H and B9H represent ‘Bayou No.3’ and ‘Bayou No.9’ from Zhangbei Town of Hebei Province,respectively

3 討論

本研究通過對來自甘肅省通渭縣華家嶺鎮和河北省張北縣張北鎮產區的燕麥品種進行真菌培養后發現，不同產地來源的燕麥種子帶菌率差異較大。甘肅華家嶺樣品消毒前后的帶菌率都高于相同處理下河北張北樣品的帶菌率，‘壩莜3號’在甘肅消毒前后的帶菌率分別高出河北11%和6%，‘壩莜9號’在甘肅消毒前后的帶菌率較河北均高出10%，這說明不同真菌對燕麥種子的侵染能力不同，產地環境的差異可能是引起燕麥種子帶菌差異的關鍵因子。李春杰等[23]研究指出，不同產地種子收獲和貯藏期間的氣候條件是影響種子帶菌率高低的關鍵因素，濕潤度越高，種子帶菌率越大。本研究中，種子貯藏期間甘肅通渭縣華家嶺鎮的年均降雨量(465 mm)和平均濕度(75.6%)明顯高于河北張北縣張北鎮(降雨量341 mm，濕度58.1%)，這為霉菌的滋生提供了有利條件，使得甘肅省燕麥種樣的帶菌率高于河北省。種子帶菌率高，不僅會致使種子生活力和貯藏壽命下降，還會對幼苗的萌發生長等產生不同程度的影響[17]。因此，為降低真菌在種子貯藏期間的侵染和增殖，應選擇在晴朗干燥的天氣快速收獲種子，及時進行晾曬，在貯藏時注意通風透氣，以保證種子的安全貯藏。

采用經典形態學分類法和rDNA-ITS序列分析法鑒定真菌種類，不僅可以克服傳統分類方法中真菌數量大、形態特征復雜和易受外界環境條件影響等不穩定因素，還能避免因基因庫完善程度低、已知物種相似性序列數量少而得出假陽性或假陰性結果，從而提高真菌分類鑒定的準確性[24-25]。因此，本研究對從燕麥種子中分離獲得的菌株通過形態學初步鑒定后，進一步利用了rDNA-ITS序列分析法進行分子鑒定，從參試材料中共檢測到13屬30種真菌，其中鏈格孢屬8種，青霉菌屬6種，曲霉屬和枝孢菌屬各3種，其它真菌屬1～2種，這說明鏈格孢菌和青霉菌是燕麥種子貯藏期間的主要侵染菌，對當地貯藏環境的生存能力較強。這跟已有的研究[26-27]結果相符，鏈格孢屬、青霉菌屬和曲霉屬等真菌是種子攜帶的主要真菌類群，這些真菌在適宜的環境條件下，具有較強的孢子萌發能力和菌絲生長能力。羅光明等[28]對不同產地來源的蔓荊子(Vitextrifoli)種子進行帶菌研究表明，不同產地間種子攜帶的真菌種類差異較大，曲霉屬在大多數產地的種子均可檢測到，鐮刀菌屬僅在山東省榮城市和威海市檢出，毛霉屬僅在江西省南昌市檢出。南志標等[29]研究表明，沙打旺(Astragalusadsurgens)種子攜帶的優勢菌為多主枝孢(Cladosporiumherbarum)，在7個產地的種子上均有發現；其次是細交鏈孢和匍柄霉(Stemphyliumbotryosum)，在大多數產地中均有檢出，而鐮刀菌、長蠕孢(Helminthosporiumsp.)和莖點霉(Phomasp.)真菌僅能在某一地發現。本試驗結果表明，不同產地來源的燕麥帶菌種類存在明顯差異，細交鏈孢、塔賓曲霉、黑附球菌和產黃青霉等真菌在2個產地均能分離到，而蔥鏈格孢菌、蘆竹節菱孢和黑曲霉等僅存在于甘肅燕麥樣本中；赤曲霉、棒囊殼菌和昏暗色串孢等僅在河北的燕麥樣本中檢出，這可能是因為不同真菌對燕麥種子的侵染能力不同，而且不同產地間氣候因子間的差異也會影響真菌的存活力和繁殖率，進而影響對種子的侵染。

先米西努爾·肉孜等[30]研究發現，苜蓿(Medicagosativa)種子未經表面消毒時的帶菌率為13.50%～87.50%，而經消毒后為3.50%～46.50%，且經消毒處理后各種真菌的檢出率較未經處理的種子顯著降低。趙輝等[31]研究表明，芝麻(Sesamumindicum)種子消毒前后的帶菌率和真菌檢出率也存在顯著差異，種子消毒前的帶菌率最高為40.70%，真菌分離率最高為87.50%；消毒后帶菌率最高為10.70%；真菌分離率最高是25%。本試驗結果表明，不進行表面消毒處理的燕麥種子帶菌率可高達100%，而經過表面消毒后種子帶菌率顯著降低(最高為19%)，這說明表面消毒處理能夠抑制某些真菌的生長，顯著減少種子的帶菌率。有研究[32-33]表明，未消毒的干種子含水量通常很低，不能滿足某些真菌的生長條件，會影響某些真菌的檢出，本研究也證實了這一點，不經表面消毒樣品攜帶的真菌有12屬28種，消毒樣品攜帶的真菌有8屬12種，其中消毒種子中攜帶的節菱孢菌和藜生鏈格孢沒有在未消毒種子上檢測到，這很可能跟這2種菌需要較多的水分才能生長有關，因對不消毒的燕麥干種子直接進行帶菌檢測，會使一些對濕度要求較高的真菌不能很好地生長。先米西努爾·肉孜等[34]研究表明，枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)和簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)等真菌僅在消毒種子上檢測到，而桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)和高大毛殼(Chaetomiumelatum)等真菌在消毒處理的種子中未檢測。本研究中蔥鏈格孢、凍土毛霉和蘆竹節菱孢等菌種僅在未消毒的種子中分離到，推測可能與該類菌對表面消毒劑次氯酸鈉比較敏感而失去活性有關。這與垂穗披堿草[19]種子和三葉草(Trifoliumsubterraneum)[35]種子的帶菌研究結果類似，認為種子經次氯酸鈉表面消毒后會影響某些真菌的分離效果，降低分離真菌的多樣性。

本試驗結果表明，燕麥種子攜帶的真菌多為鏈格孢屬和青霉菌屬等腐生真菌。多數情況下，這些腐生菌可在潮濕的環境中迅速繁殖，甚至侵入種子內部使種胚死亡，降低發芽率或造成出苗前的爛種和爛根[36-38]，而且大多數腐生菌的寄主范圍都非常廣泛，可以通過侵染田間雜草完成其生活史或者越冬，在適宜條件下發生病原菌的再次傳播，成為病害的初侵染源[39-41]。但種子在貯藏過程中所產生的腐生真菌并不都是致病菌，本文檢測到的種帶真菌是否具有致病性，還需要進一步根據柯赫氏法則進行驗證。

4 結論

同一品種在不同產地的帶菌率、帶菌種類和分離率差異顯著，不同品種在同一產地的帶菌情況也存在明顯差異，甘肅華家嶺燕麥種子消毒前后的帶菌率都較高于河北張北的種子，其中蔥鏈格孢、離生青霉和多孢枝孢等真菌僅在甘肅華家嶺種樣中檢出；而赤曲霉、棒囊殼菌和橘灰青霉等僅存在于河北張北的種樣中。種子是否經表面消毒對其帶菌情況也有顯著影響，未消毒種子帶菌率明顯高于消毒種子，消毒處理會影響某些真菌的檢出。