遮陰脅迫對麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落結構和多樣性的影響

羅藝嵐，趙東豪，孫鵬越，高金柱，呼天明，付娟娟

(西北農林科技大學草業與草原學院，陜西 楊凌 712100)

在城市園林綠化中，常采用喬、灌、草三者相結合的方式[1]，這給草坪帶來無法避免的遮陰脅迫。遮陰導致藍光和紅光比例增加，空氣流通減緩使小環境濕度升高，空氣和土壤表層溫度發生改變，進而影響草坪的坪用特性[2]。長期處于陰蔽的環境下，給草坪草的生長帶來諸多不利的影響。長期遮陰導致草坪草生長瘦弱細小[3]，遮陰導致葉面積增大，葉片厚度降低，葉片解剖結構改變[4]，且難以抵抗踐踏、病蟲害、低溫、干旱等生物與非生物逆境脅迫傷害，從而降低草坪的質量[5,6]。對遮陰脅迫下高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)的研究發現，遮陰增加了胞間CO2濃度，降低了葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導度、呼吸速率和光反應系統II的最大光化學效率等，從而抑制高羊茅的光合作用[7]。Li等[8]研究也發現遮陰脅迫影響植物的正常生長，一方面表現為分配到葉的生物量增加，而分配到同化枝的生物量降低；另一方面，遮陰導致同化枝的直徑和葉厚度降低，而促進同化枝的長度和葉面積的增加。

由于遮陰引起土壤表層溫度和濕度改變，這些改變會引起土壤理化性質和微生物群落結構及其多樣性發生相應的變化。然而，目前關于草坪草根際土壤微生物群落對遮陰脅迫響應機理的研究鮮有報道。本試驗以耐陰性強的麥冬和不耐陰的多年生黑麥草為研究對象，分別采集其遮陰脅迫下的根際土壤，通過16S rRNA高通量測序平臺，研究遮陰對其根際土壤細菌群落組成、多樣性等方面的影響，并分析土壤理化因子對其根際土壤微生物群落結構的影響，揭示麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落對遮陰脅迫的響應機制。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為耐陰性強的麥冬(Ophiopogonjaponicus(Linn. f.) Ker-Gawl.,縮寫為OJ)和耐陰性較差的多年生黑麥草(LoliumperenneL. ‘ph.D.’，縮寫為LP)。

供試草坪建植于2007年，于2017年10月在西北農林科技大學麥冬和多年生黑麥草草坪(34°17′25″ N，108°4′1″ E，海拔539.2 m)采用五點取樣法采集土壤樣品。土壤樣品的基本理化性狀見表1。

1.2 試驗設計

本試驗在日光溫室進行，待植株長至15 cm時，采用遮陰布進行遮陰處理，以在正常條件下生長為對照。麥冬和多年生黑麥草分別設置2個遮陰梯度，分別為未處理的多年生黑麥草(LP.0d)、遮陰處理7 d的多年生黑麥草(LP.S.7d)、遮陰處理14 d的多年生黑麥草(LP.S.14d)、正常條件生長7 d的對照組多年生黑麥草(LP.L.7d)、正常條件生長14 d的對照組多年生黑麥草(LP.L.14d)；未處理的麥冬(OJ.0d)、遮陰處理7 d的麥冬(OJ.S.7d)、遮陰處理14 d的的麥冬(OJ.S.14d)、正常條件生長7 d的對照組麥冬(OJ.L.7d)和正常條件生長14 d的對照組麥冬(OJ.L.14d)。每個處理6盆(13.5 cm×17.5 cm×11.0 cm)，每盆15株，總計60盆，分別于遮陰處理7 d和14 d后，每盆取樣3株，采用抖土法[9]采集其根際土壤樣品，過篩(孔徑2 mm)后裝入冰盒后帶回實驗室，置于滅菌的離心管中，凍存于—80℃冰箱，用于根際土壤細菌16S rRNA測序分析。其余土壤鮮土樣品去除植物根系、枯枝落葉等雜物，一部分鮮土樣用于測定土壤銨態氮和硝態氮含量，另一部分風干研磨后過篩(孔徑0.25 mm)，聚乙烯袋中密封保存，用于測定土壤pH、全氮、全磷、全鉀、有機質等。

1.3 測定方法

1.3.2土壤DNA的提取、PCR擴增以及16S rRNA基因的高通量測序 土壤總DNA的提取使用美國MoBio公司的Power Soil DNA Extraction Kit試劑盒(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA)，每個土壤樣品稱取0.3 g，依據試劑盒說明提取土壤總DNA。采用引物F515 (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和R806(5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)[11]擴增土壤微生物16S rRNA基因V4區。經純化后的雙端序列送至深圳華大基因研究院(Shenzhen Huada Gene Research Institute,BGI)利用Illumina HiSeq2500測序平臺進行Paired-end測序。

1.3.3數據的分析處理 測序所得結果使用FLASH (v1.2.11)軟件[12]進行序列過濾，去除掉長度小于15 bp和錯配堿基數>0.1的序列。并運用UCHIME(v4.2.40)[13]的方法去除USEARCH GLOBAL數據庫中的嵌合體序列。OTU (Operational Taxonomic Units)聚類分析通過USEARCH(v7.0.1090)方法[14]對序列按相似度0.97進行聚類，并通過USEARCH GLOBAL方法選取每個類中的代表序列[15]。對比USEARCH GLOBAL數據庫，采用Ribosomal Database Project(RDP)(v.2.2)分類方法得到每個OTU的物種分類信息。利用Mothur(v1.31.2)軟件進行α多樣性分析(包括Sob指數、Chao指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數)。基于Bray-Curtis距離，使用QIIME(v1.80)軟件進行β多樣性分析。使用vegan(v2.4.2)軟件進行Mantel檢驗(9,999 permutations)和典型相關分析(Canonical Correlation Analysis,CCA)對土壤理化性質和根際土壤細菌群落組成作相關性分析。Kruskal-Wallis檢驗用于分析土壤微生物組成對遮陰脅迫的響應。采用SPSS 19.1 軟件進行ANOVA分析，用LSD法分析遮陰對土壤理化性質影響的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 遮陰脅迫對土壤理化性質的影響

如表1所示，遮陰脅迫導致土壤理化性質發生改變。與對照相比，遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤的硝態氮含量都顯著增加(P<0.05)，而TP，TK和AK含量降低，其中多年生黑麥草降低趨勢更為顯著。遮陰脅迫對麥冬和多年生黑麥草土壤銨態氮和AP含量的影響存在顯著差異，表現為遮陰脅迫顯著降低麥冬土壤銨態氮的含量，增加AP的含量(P<0.05)，而對多年生黑麥草土壤的影響卻恰恰相反。遮陰脅迫對麥冬和多年生黑麥草土壤TN含量、有機碳(Organic C)含量、碳氮比(C∶N ratio)以及pH值的影響不顯著。

表1 遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤的理化性質

注：OJ：麥冬(Ophiopogonjaponicus(Linn. f.) Ker-Gawl.)；LP：多年生黑麥草(LoliumperenneL.)；OJ.0d和LP.0d：處理0 d；OJ.L.7d和LP.L.7d：正常光照生長7 d；OJ.L.14d和LP.L.14d：正常光照生長14 d；OJ.S.7d和LP.S.7d：遮陰處理7 d；OJ.S.14d 和LP.S.14d：遮陰處理14 d；表中數據表示六個重復的平均值；表中同列不同行的不同字母表示差異顯著(***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)，下同

Note:OJ.0d and LP.0d indicates Control (0 d);OJ.S.7d and LP.S.7d indicates shade for 7 d;OJ.S.14d and LP.S.14d indicates shade for 14 d;OJ.L.7d and LP.L.7d indicates light (sunny) for 7 d;OJ.L.14d and LP.L.14d indicates light (sunny) for 14 d. Values are the means of six pot replicates. Different lowercase or capital letters indicate significant differences (P< 0.05,LSD test) in OJ (Ophiopogonjaponicus,shade tolerant) or LP (Loliumperenne, shade-intolerant) soil. (***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05). The same as below

2.2 OTU聚類與多樣性分析

ACE指數、Sob指數和Chao指數反映樣品中群落的豐富度，而Shannon指數和Simpson指數反映群落的多樣性。不同處理的ACE指數為5 817.98～6 039.97，Chao指數為5 774.20～6 007.40，Sob指數為4 539.17～4 726.67，香濃指數為6.61～6.86，辛普森指數為0.0057～0.0107(表2)。遮陰脅迫不同程度地改變麥冬和多年生黑麥根際土壤細菌群落的α多樣性。Kruskal-Wallis檢驗分析結果表明，遮陰脅迫對麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落的ACE指數、Chao指數、Sob指數和香濃指數均沒有顯著影響(P>0.05)，但是顯著影響其辛普森指數。遮陰脅迫下麥冬根際土壤細菌群落的辛普森指數較對照增加，而多年生黑麥草根際土壤細菌群落則呈現相反變化趨勢(表2)。

表2 遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落α多樣性統計

注：表中同列不同行的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercase or capital letters indicate significant differences (P<0.05,Kruskal-Wallis test)

主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)對細菌群落結構變異的解釋量為64.06%(圖1)。麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落單獨聚類。麥冬根際土壤的細菌群落基本都在第一、四象限，其中不進行遮陰處理(OJ.L.14d和OJ.L.7d)的距離近，與遮陰處理(OJ.S.14d和OJ.S.7d)單獨聚類。多年生黑麥草根際土壤的微生物基本都分布在第二、三象限，遮陰處理OJ.S.14d和OJ.S.7d單獨聚類。這些結果表明遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落結構存在顯著差異。

圖1 PCoA分析遮陰脅迫對麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落β多樣性的影響

2.3 遮陰脅迫對兩種草坪草根際土壤細菌群落組成的影響

在門水平上，共獲得46個類群，其中11個門為優勢類群(相對豐度> 1%)。麥冬根際土壤中的優勢菌門有6個，分別為變形菌門(Proteobacteria)，相對豐度為26.34%～35.23%；酸桿菌門(Acidobacteria)，相對豐度為19.79%～24.24%；奇古菌門(Thaumarchaeota)，相對豐度為8.95%～10.86%；浮霉菌門(Planctomycetes)，相對豐度為7.97%～9.22%；擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對豐度為7.35%～9.40%；綠彎菌門(Chloroflexi)，相對豐度為3.71%～7.37%。多年生黑麥草中的優勢菌也有6個，分別為酸桿菌門(Acidobacteria)，相對豐度為19.20%～32.96%；變形菌門(Proteobacteria)，相對豐度為19.03%～24.49%；奇古菌門(Thaumarchaeota)，相對豐度為9.38%～11.06%；擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對豐度為7.59%～10.49%；放線菌門(Actinobacteria)，相對豐度為4.04%～10.05%；浮霉菌門(Planctomycetes)，相對豐度為8.15%～8.72%。遮陰脅迫導致麥冬根際土壤中變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度明顯增大，疣微菌門(Verrucomicrobia)的豐度明顯降低(P<0.01)。然而，遮陰脅迫處理下多年生黑麥草根際土壤中疣微菌門(Verrucomicrobia)和酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度顯著高于麥冬根際土壤(圖2A)。

在屬水平上，共鑒定25個類群。其中相對豐度高于0.5%的菌群有12個，分別屬于α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、浮霉菌綱(Planctomycetia)、Spartobacteria菌綱(Spartobacteria)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira)和奇古菌綱(Thaumarchaeota)。麥冬根際土壤中的優勢菌屬分別為Candidatus_Nitrososphaera菌屬(Candidatus_Nitrososphaera)(8.93%～10.86%)、硝化螺菌屬(Nitrospira)(0.96%～2.92%)、Kaistobacter菌屬(Kaistobacter)(0.98%～2.38%)、Steroidobacter菌屬(Steroidobacter)(0.81%～2.02%)和黃桿菌屬(Flavobacterium)(0.62%～0.85%)；而多年生黑麥草根際土壤中的優勢菌屬分別為Candidatus_Nitrososphaera菌屬(Candidatus_Nitrososphaera)(9.38%～11.06%)、Kaistobacter菌屬(Kaistobacter)(0.81%～1.47%)、Steroidobacter菌屬(Steroidobacter)(0.34%～0.74%)和黃桿菌屬(Flavobacterium)(0.42%～0.69%)。遮陰脅迫引起麥冬和多年生黑麥草根際土壤中硝化螺菌屬(Nitrospira)、Steroidobacter菌屬(Steroidobacter)、Kaistobacter菌屬(Kaistobacter)和小梨形菌屬(Pirellula)發生顯著改變，這些菌屬在麥冬根際土壤中呈現增加趨勢，而在多年生黑麥草根際土壤中則表現為下降趨勢(P< 0.01)。另外，遮陰脅迫下麥冬根際土壤中紅游動菌屬(Rhodoplanes)、浮霉菌屬(Planctomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)相對豐度顯著高于多年生黑麥草，而在多年生黑麥草根際土壤中出芽菌屬(Gemmata)具有較高相對豐度(P<0.001)(圖2B)。

圖2 遮陰對麥冬和多年生黑麥草根際土壤中細菌群落門水平(相對豐度>1%)(A)和屬水平(0.5%)(B)的組成的影響

2.4 遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落結構與環境因子相關性分析

為了分析土壤理化因素對遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落結構的影響，對細菌群落組成與土壤理化性質進行Mantel相關性分析，結果如表3所示。在遮陰脅迫下，土壤中銨態氮、硝態氮、全鉀是影響土壤中細菌群落結構的主要因素(P<0.05)。

表3 遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落結構與環境因子相關性分析

為進一步分析不同土壤理化性質對細菌群落結構的影響，對細菌群落結構與土壤理化性質進行典型相關分析(CCA)。研究結果顯示，土壤速效鉀和全氮是影響麥冬根際土壤細菌群落組成的主要因子。速效鉀和全氮與麥冬根際土壤中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠灣菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和WS3菌門正相關(P<0.05)(圖3A)。

銨態氮、硝態氮和全氮是影響多年生黑麥草根際土壤細菌群落組成的主要環境因子。其中，銨態氮和全氮與放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和奇古菌門(Thaumarchaeota)正相關(P<0.05)，而硝態氮與疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和WS3菌門正相關(P<0.01)(圖3B)。

3 討論

根際土壤微生物對環境變化異常敏感，其種類和數量受土壤養分、植物和環境因子的共同影響[16]。遮陰脅迫引起光強、光質、空氣和土壤溫濕度等環境因子發生變化，進而影響草坪質量。

圖3 典型相關分析遮陰脅迫下環境因子對麥冬(A)和多年生黑麥草(B)根際土壤細菌群落結構的影響

3.1 遮陰脅迫對麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌多樣性的影響

PCoA分析結果表明，麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落在第一主坐標軸上能明顯區分開，說明兩者之間的相似性很小，存在顯著差異，這進一步說明植物本身對土壤細菌群落組成的影響強于遮陰脅迫處理。對根際土壤細菌群落豐富度和多樣性研究發現，遮陰脅迫沒有顯著影響麥冬和多年生黑麥草根際土壤中細菌群落的豐富度和多樣性，相似的結果在干旱和鹽脅迫對土壤細菌群落的影響也有報道[17,18]。

3.2 遮陰脅迫對麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌組成的影響

遮陰脅迫顯著改變麥冬和多年生黑麥草根際土壤中細菌群落組成。在門水平上，麥冬根際土壤中相對豐度較高的為變形菌門和放線菌門。遮陰脅迫下，麥冬根際土壤中這些菌群呈現增加趨勢，而在多年生黑麥草根際土壤中則表現為下降趨勢。研究[19-22]發現，變形菌門和放線菌門的細菌能夠提高植物干旱、鹽、重金屬等多種非生物脅迫抗性，這一結果可能與麥冬和多年生黑麥草本身的耐陰性差異有關。遮陰脅迫下，麥冬根際土壤中α-變形菌綱和γ-變形菌綱的菌群發揮重要作用，其中幾個屬包括Kaistobacter菌屬(Kaistobacter)，Steroidobacter菌屬(Steroidobacter)和假單胞菌屬的相對豐度隨著遮陰脅迫的延長表現為增加趨勢，這可能與麥冬較強的耐陰能力有關。已有研究[23,24]報道，根際接種假單胞菌屬植物生長促生菌能夠有效地激活植物的多種代謝防御機制，從而提高植物的生物與非生脅迫抗性，本試驗研究結果與其一致，遮陰脅迫下耐陰性強的麥冬根際土壤中假單胞菌屬(Pseudomonas)相對豐度顯著高于不耐陰的多年生黑麥草。

3.3 遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落組成與土壤理化性質相關性分析

為了進一步揭示遮陰影響麥冬和多年生黑麥草根際土壤細菌群落的影響，本試驗分析了土壤理化性質與細菌群落組成的相關性。本研究發現，遮陰不同程度地改變麥冬和多年生黑麥草根際土壤的理化性質，進一步Mantel檢驗和CCA分析表明，土壤中銨態氮、硝態氮、全氮、速效鉀與根際土壤中細菌群落組成相關性較大，其中，速效鉀和全氮是改變麥冬根際土壤中芽單胞菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門和WS3相對豐度的主要因素，而全氮、銨態氮和硝態氮是影響多年生黑麥草根際土壤細菌群落結構的主要因素，這可能是由于遮陰脅迫下麥冬和多年生黑麥草與土壤相互作用的反饋機制不同。相似的研究也表明銨態氮和總氮是影響脅迫下土壤細菌群落結構和多樣性的主要環境因子[25,26]，這主要是由于銨態氮是細菌的主要氮源[27]。Chodak等[28]對土壤理化性質與土壤微生物群落相互作用的研究表明，土壤pH是導致干旱脅迫下土壤中變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門等細菌群落組成的主要因素。本試驗研究結果與其不一致，可能是由于遮陰和干旱作為不同的非生物脅迫導致土壤理化性質改變差異加大所致，具體原因有待進一步探究。

4 結論

遮陰脅迫可顯著改變麥冬和多年生黑麥草根際土壤中細菌群落的結構，但對其多樣性影響不顯著。

遮陰脅迫改變了麥冬和多年生黑麥草土壤的理化性質，對土壤中細菌優勢類群相對豐度也產生了一定的影響，其中，速效鉀和全氮是改變麥冬根際土壤優勢細菌群落相對豐度的主要原因，而全氮、銨態氮和硝態氮是影響多年生黑麥草根際土壤細菌群落結構的主要因素。