兩波長變化HPLC法同時測定護肝片中5種主要成分的含量

唐 霄 ，張翠欣（河北醫科大學第三醫院臨床藥學部，河北 石家莊 050051）

護肝片是由柴胡、茵陳、板藍根、五味子、豬膽粉和綠豆6味藥材制成的中成藥，臨床上可用于慢性肝炎和早期肝硬化的治療，也是肝移植術后常用的保肝藥物。茵陳作為護肝片的主藥之一，具有清濕熱、退黃疸的功效，能夠增加膽汁分泌，并參與膽汁酸及某些有毒物質的代謝，其主要酚酸類成分綠原酸具有保肝利膽、抗菌消炎的作用[1-3]。綠豆中的黃酮類成分可以緩解急性酒精性肝損傷[4]，牡荊苷是綠豆中重要的黃酮類成分，能夠提高肝臟抗氧化能力，清除羥基自由基，減輕肝細胞損傷[5]。2015版藥典僅將五味子醇甲作為護肝片含量測定的標準，對于其他成分的含量未見規定[6]。本文對護肝片中綠原酸、牡荊苷、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素進行同時測定，為改進護肝片的質量標準提供技術基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司，包括G1311A四元泵、G1322A在線脫氣機、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測器、Agilent色譜工作站）；AX205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；HS2060型超聲波清洗器（天津市恒奧科技發展有限公司）。

1.2 試劑與藥品

護肝片（黑龍江葵花藥業股份有限公司，批號201610051，201703067，201801033）；對照品綠原酸（批號110753-201817，含量96.8%）、牡荊苷（批號111687-201704，含量94.9%）、五味子醇甲（批號110857-201714，含量99.9%）、五味子甲素（批號110764-201714，含量99.3%）、五味子乙素（批號110765-201512，含量99.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，Fisher公司）；磷酸（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫（見表1）；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：0 ～ 20 min為340 nm，20 ～ 40 min為254 nm；進樣量：20 μL。理論塔板數以五味子醇甲計應不低于3000。

表 1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別取綠原酸、牡荊苷、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成濃度為0.4、0.2、0.7、0.5、0.4 mg·mL-1的儲備液。精密量取各對照品儲備液，加甲醇稀釋，制成質量濃度分別為0.080 0、0.040 0、0.122 5、0.037 5、0.040 0 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取護肝片10片，除去包衣，粉碎，取0.35 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入體積分數為50%的甲醇20 mL，稱量，超聲提取（60 W，頻率40 kHz）30 min，放冷至室溫，再次稱量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例取不含茵陳、五味子和綠豆的其他藥材，按照護肝片的制備工藝制成陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性實驗

分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。對照品和供試品中的各成分與其相鄰色譜峰均能實現良好分離，且分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A - 混合對照品，B - 陰性對照樣品，C - 樣品；1 - 綠原酸，2 - 牡荊苷，3 - 五味子醇甲，4 - 五味子甲素，5 - 五味子乙素Fig 1 HPLC chromatogramsA - mixed reference substance, B - negative control, C - sample; 1- chlorogenic acid, 2 - vitexin, 3 - schisandrol A, 4 - schisandrin A, 5 - schisandrin B

2.4 線性關系考察

精密量取混合對照品溶液，加50%甲醇稀釋1倍、2倍、4倍、8倍、16倍，即得系列濃度溶液，各取20 μL進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算各成分的回歸方程和相關系數（r）。結果表明，5種成分在各自濃度范圍內線性關系良好，r ≥ 0.999 9，見表2。

表2 護肝片中5種成分的回歸方程、相關系數和線性范圍Tab 2 Regression equation, correlation coefficient and linear range of five components in Hugan tablets

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，考察精密度。重復進樣6次，綠原酸、牡荊苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為2.52%、1.63%、1.08%、3.30%和0.65%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批次護肝片，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進樣分析，考察方法的重復性。綠原酸、牡荊苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為1.97%、1.89%、0.65%、2.72%、1.68%，表明本方法的重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于配制后0、3、6、9、12、24 h進樣分析，測定各成分的峰面積。綠原酸、牡荊苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為1.48%、1.66%、0.70%、2.87%、0.93%，表明供試品中待測成分在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批護肝片粉末6份，每份約0.175 g，各置于錐形瓶中，分別加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件分別進樣20 μL，計算回收率。結果見表3。

2.9 樣品含量測定

取3個批次的護肝片，每個批次按“2.2.2”項下方法制備3份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，分別計算5種成分的含量。3個批次護肝片含量測定結果見表4。其中五味子醇甲的含量符合藥典標準（0.28 mg·片-1）。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

綠原酸、牡荊苷、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素均能溶于甲醇，且綠原酸含有羧酸結構，極性較大，選用不同的提取溶劑（50%、75%、100%甲醇）進行試驗，結果表明，使用50%甲醇提取可使綠原酸的峰形最高，且其他成分都能獲得良好的峰形。此外，還考察了溶劑用量（15、20、30、50 mL）和超聲時間（20、30、40 min）對實驗結果的影響，發現使用20 mL 50%甲醇超聲提取30 min可獲得最佳提取結果。

表3 護肝片中5種成分的回收率Tab 3 Recovery rate of five components in Hugan tablets

表4 樣品含量測定結果. mg·片-1Tab 4 Determination results of sample content. mg·tablet-1

3.2 流動相的選擇

在護肝片的含量測定中，之前的文獻大多采用乙腈作為流動相[7-10]，但乙腈價格昂貴，毒性大，本實驗證實采用價格低廉且低毒的甲醇作為流動相也可以獲得良好的峰形。綠原酸為有機酸，在酸性環境中比較穩定，在水系中添加少量磷酸可使綠原酸獲得較好的峰形。比較了磷酸濃度為0.05%、0.10%、0.20%、0.30%時的實驗結果，發現磷酸濃度為0.05%時色譜峰峰形差，使用0.2%磷酸獲得的峰形最好，因此確定流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液。另外，ZORBAXSB-C18柱能夠耐受pH≥1的偏酸性環境，0.2%磷酸水溶液的pH值大約為1.95，所以使用該色譜柱可以滿足試驗需求。

3.3 柱溫的選擇

對于柱溫的選擇，考察了柱溫為25、30、35 ℃時的色譜圖，隨著溫度升高，色譜峰保留時間縮短，柱溫為35 ℃時峰形良好，因此確定柱溫為35 ℃。

3.4 檢測波長的選擇

根據2015版中國藥典[6]及相關文獻[11-13]，綠原酸的最大吸收波長在327 nm，牡荊苷在340 nm，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素在254 nm附近，由于綠原酸與牡荊苷的最大吸收波長相近，在327 nm波長下，牡荊苷的峰值較低，在340 nm時，綠原酸與牡荊苷的峰值均較好，因此確定檢測波長0 ～ 20 min為340 nm、20 ～ 40 min為254 nm。

綜上，中藥制劑所含成分復雜，其藥理作用是所有藥材共同作用的結果，同時測定制劑中多種藥材主要成分的含量對于研究其體外和體內作用具有重要意義。已有文獻有測定護肝片中多種五味子木脂素的報道[7]，也有測定綠原酸的報道[8-9]，但對于護肝片中牡荊苷的含量測定報道較少。本文選取護肝片中三種藥材的5種有效成分進行含量測定，并且采用甲醇作為流動相，能夠降低檢測成本，測定方法簡便，材料易得，為護肝片的含量測定提供了新思路。