阻斷TNF-α可改善苯并芘誘導的肺慢性炎癥

羅賢強，陳如章，高基民

(溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325006)

肺癌是發病率與死亡率最高的惡性腫瘤[1]。香煙煙霧中存在多種致癌物，其中苯并芘是最為明確且典型的完全致癌物，已被國際癌癥研究機構歸入致癌物的第一組[2]。苯并芘在環境中分布廣泛，主要存在于煤炭、石油等礦石燃料不完全燃燒產生的煙氣和香煙煙霧中，人類每天通過吸煙或被污染的空氣、食物、水等途徑攝入一定量的苯并芘[2]。

苯并芘常用于在動物模型中誘發肺相關腫瘤，而這些腫瘤與人原發性肺癌在組織病理學特征上極為相似[3]。實驗動物注射苯并芘的劑量與吸煙者一生中所暴露的苯并芘劑量相當[4]，在苯并芘給藥后相對較短時間內，隨著年齡的增長，小鼠自發性長出大量腫瘤[5]。因此，小鼠模型已廣泛用于苯并芘致肺癌作用及其干預研究[6]。

癌癥的發生發展是多個階段和步驟的過程[7]。研究表明，肺慢性炎癥是環境致癌物導致肺癌發生發展的重要因素[8-9]。苯并芘可通過氧化應激等誘導肺持續高表達腫瘤壞死因子α(TNF-α)，促使肺部慢性炎癥的形成與維持，進而導致肺癌[2,10]。因此，該研究擬在苯并芘誘導的肺慢性炎癥階段通過阻斷TNF-α的表達，來改善肺局部炎癥微環境，從而達到預防甚至延緩肺癌的發生發展的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡SPF級雄性昆明小鼠購于北京聯合利華，引進飼養在溫州醫科大學動物實驗中心，體重(60±5)g。苯并芘、玉米油購自Sigma公司，流式抗體Pacifice Blue anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD11b、PE-cy7 anti-mouse F4/80、PE anti-mouse CD86等購自BioLegend公司，小鼠組織細胞消化試劑Collagenase IV、DNase I購自Sigma公司，β-巰基乙醇、IMDM培養基、胎牛血清購自Gibco公司。治療用TNF-α拮抗劑為安佰諾，購自浙江海正藥業。

1.2 方法

1.2.1 模型構建

將小鼠隨機分為苯并芘暴露組與溶劑(玉米油)對照組。處理組小鼠經右側胸腔肋間隙注射苯并芘(苯并芘溶于玉米油)，每周注射1次，每次1 mg·只-1，連續注射4周。溶劑對照組小鼠注射相同劑量玉米油，每周注射1次，連續注射4周。

1.2.2 動物分組及給藥

在小鼠苯并芘暴露第31天，將暴露小鼠隨機分成2組，每組10只。抗TNF-α(anti-TNFα)治療組小鼠經腹腔給藥0.5 mg TNF-α拮抗劑，連續注射1周；治療對照組小鼠腹腔注射等質量PBS，連續注射1周。在苯并芘暴露180 d后處死小鼠，稱重并采樣以供檢測。

1.3 樣品測定

1.3.1 小鼠肺組織形態觀察

將小鼠肺組織取出，10%中性福爾馬林固定，石膏包埋，連續切片，HE染色，光鏡下觀察組織形態變化，比較炎癥細胞浸潤程度及腫瘤細胞浸潤情況。

1.3.2 小鼠肺組織巨噬細胞及共刺激分子表達

將小鼠肺組織取出，研磨消化制成單細胞懸液，200目尼龍膜過濾，流式抗體染色，4 ℃避光孵育30 min，IMDM培養基清洗3次，用含細胞死活染料7-AAD的2% FBS buffer重懸，流式上機檢測。

1.4 數據分析

流式細胞儀檢測數據用Flowjo軟件分析，用GraphPad Prism 7.0進行統計學差異分析。所有數據均以均值±標準差表示，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 小鼠肺組織形態

如圖1所示，PBS治療對照組小鼠肺組織結構內多量炎性細胞浸潤并出現腺樣結構；抗-TNF-α處理小鼠肺部炎癥細胞浸潤明顯減少；溶劑對照組小鼠肺組織結構清晰，無明顯改變。

A—溶劑對照組；B—PBS治療對照組；C—抗-TNF-α處理組。圖1 小鼠肺組織切片(400×)

2.2 小鼠肺組織巨噬細胞浸潤情況

大多數腫瘤的發生與遷延不愈的炎癥緊密相關，局部慢性炎癥微環境能促進腫瘤進展和轉移[11]。如圖2所示，苯并芘暴露小鼠肺部巨噬細胞浸潤明顯增加。抗TNF-α治療可減少其肺部浸潤，但尚未達到統計學差異(圖3)，可能是由于檢測樣本是整個右肺消化成的單個細胞樣本，無法體現局部炎癥微小差異。

A—溶劑對照組；B—PBS治療對照組；C—抗-TNF-α處理組。圖2 不同處理小鼠肺組織巨噬細胞的流式散點圖

圖3 不同處理小鼠肺部巨噬細胞水平

2.3 小鼠肺組織巨噬細胞共刺激分子表達水平

炎癥不僅上調APC細胞膜上MHCⅡ分子的表達，并能穩定膜上MHCⅡ-抗原復合物[12-13]。如圖4所示，苯并芘暴露小鼠肺部CD86陽性與CD86/MHCⅡ雙陽巨噬細胞比例均顯著增高，抗TNF-α治療能不同程度降低巨噬細胞CD86與MHCⅡ的表達，表明抗TNF-α治療減少了肺部炎癥刺激因子的產生，改善了肺部炎癥微環境。

3 討論

介導促進慢性炎癥的因素同時可以促進腫瘤的發生發展[7,13]。炎癥是一個復雜的過程，涉及免疫和非免疫細胞之間的相互作用，慢性炎癥為癌癥提供了重要的致癌環境[13]。苯并芘是香煙中最為明確和典型的重要致肺癌化合物。苯并芘易被吸收，能通過呼吸道、口腔和皮膚等途徑進入人體，是吸煙及大氣污染的主要致癌物之一[2]。苯并芘可以直接作用于實驗動物(包括小鼠、大鼠)，直觀地展現腫瘤發生發展過程中出現的各種細胞分子事件[6]。

A—各處理小鼠肺部CD86陽性巨噬細胞散點圖與CD86陽性巨噬細胞占比；B—各處理小鼠CD86/MHCⅡ雙陽性巨噬細胞流式散點圖與CD86/MHCⅡ雙陽巨噬細胞占比。圖4 不同處理小鼠肺部炎癥細胞共刺激分子表達水平

TNF-α表達持續上調對苯并芘誘導的肺慢性炎癥形成與維持，以及肺癌的發生發展具有重要的作用[2]。TNF-α是調節炎癥的主要因子，也是確保組織穩態的關鍵參與者[14]。已有研究發現，TNF拮抗劑可調節炎性反應[15]。本研究中，與溶劑對照組小鼠相比，苯并芘暴露小鼠肺部巨噬細胞浸潤程度顯著增加，而經抗TNF-α治療后肺部巨噬細胞浸潤程度整體有所下降。在炎癥因子的刺激下，炎癥細胞表面共刺激分子CD86與MHCⅡ類分子表達上調[16-17]。苯并芘暴露小鼠與正常小鼠相比，肺部巨噬細胞MHCⅡ與CD86表達水平上調，經抗TNF-α治療后，細胞表面MHCⅡ與CD86表達不同程度地降低。抗TNF-α治療可改善苯并芘誘導的肺局部炎癥狀況，并且延緩了肺組織病理改變。以上研究結果為預防環境致癌物暴露誘發的肺癌提供了初步研究基礎。