畜禽糞污除臭微生物的篩選與鑒定

沈琦，孫筱君，吳逸飛，姚曉紅，李園成，孫宏，王新，湯江武*

(1.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.華中農業大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430070)

由于畜禽養殖業的規模化發展，畜禽糞污所產生的惡臭、氮磷、添加劑及重金屬污染日益嚴重，已經威脅到農業社會的可持續發展，畜禽糞污已成為我國農業面源污染的主要來源之一[1]，產生的惡臭氣體對周圍環境及居民的生活造成了嚴重影響。畜禽糞污產生的惡臭氣體主要成分為氨、揮發性含硫化合物、揮發性脂肪酸、吲哚類和酚類[2]，不僅對人類嗅覺產生心理厭惡等不愉快的感覺外，還會對人和動物的呼吸、消化、神經系統等造成不同程度的毒害[3]。因此，進行畜禽糞污的除臭研究變得尤為迫切。

惡臭氣體的常見處理方法有物理法、化學法和生物法，其中生物法通過微生物的生理代謝過程來降解惡臭物質，具備投資少、費用低、操作方便且不會造成二次污染等優點[4]，已經成為現階段畜禽糞污除臭研究的研究熱點。研究發現，氨氣和硫化氫是最主要的惡臭物質，氨氣的揮發量與糞污中其他致臭物質高度相關，減少氨氣的揮發可以有效降低糞污惡臭[5]，因而篩選高效的氨氣同化微生物及硫化氫同化微生物，進行生物脫臭，可以有效控制畜禽糞污產生的惡臭。本試驗從浙江省某養豬場的糞污及周圍土壤中分離除臭微生物，以期用于畜禽糞污的除臭，豐富臭氣治理的菌種庫。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本采集于浙江省內的3個大型養豬場，樣本為不同養豬場中豬的糞便、豬糞周圍土壤，各樣本采集約50 g。將不同地點采集的同種樣本均勻混合后放入冰盒中保存，備用。商品菌劑(LD)購自福建洛東生物技術有限公司。

1.2 培養基

試驗用培養基配方如下。YPD培養基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；LB培養基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；PDA培養基：土豆200.0 g，蔗糖20.0 g，酵母膏2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，硫酸鎂1.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；NH3選擇性培養基：蔗糖50.0 g，氨水10.0 mL，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.1 g，1% ZnSO45.0 mL，NaCl 2.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；H2S選擇性培養基：葡萄糖5.0 g，K2HPO40.5 g，KNO31.0 g，MgCl20.5 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 0.5 g，Na2CO31.0 g，FeCl20.01 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；分離純化培養基：KH2PO42.0 g，NH4Cl 0.4 g，Na2CO30.4 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，加蒸餾水至1 000 mL，2%瓊脂。

1.3 方法

1.3.1 菌種的富集馴化

各取5 g風干樣本分別接入100 mL NH3和H2S選擇性培養基，30 ℃、220 r·min-1搖床培養，2 d后更換培養基，吸取10 mL馴化培養液加入100 mL新鮮的選擇性培養基中進行第2代馴化，連續富集馴化4次。

1.3.2 菌種的分離純化

取富集液10 mL于盛有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩20 min，靜置1 min。用10倍稀釋法，將不同梯度的稀釋液涂布于氨氣和硫化氫的選擇性培養基。取0.2 mL菌液分別涂布在不同的固體分離平板培養基上，設置3個重復試驗，置于30 ℃恒溫培養箱內培養，3～5 d將分離平板中的菌落采用平板劃線法進一步純化，將特征不同的菌落分別接種于相應的斜面培養基上培養后，保存備用，挑取分離后的菌株接種于相應的液體培養基上，30 ℃、220 r·min-1搖床擴大培養3 d。

1.3.3 除臭菌株的初篩

取新鮮的豬糞200 g置于1 000 mL大燒杯中，按照3%的接種量將菌液接種于燒杯中，用玻璃棒將培養液與豬糞混合均勻，密封燒杯，對照組(CK)為等量的無菌水，每組3個重復，30 ℃靜止培養7 d，通過感官方法判斷微生物的除臭效果。感官法判斷標準[6]：0級，未聞到任何氣味，無任何反應；1級，勉強聞到氣味，但不明顯；2級，聞到較弱氣味；3級，很容易聞到氣味；4級，臭味很大，想離開；5級，臭味極強，立即離開。

1.3.4 除臭菌株的復篩

選擇初篩中具有較好除臭效果的菌株進行復篩試驗，以5%接種量將菌株接種至相應培養基，培養成菌液。稱取500 g新鮮豬糞放入2 L大燒杯中，按照3%接種量接種菌液到燒杯中，用玻璃棒充分混勻，同時以加等量無菌水處理作為空白對照組。在大燒杯中放置2個50 mL小燒杯，一個裝有20 mL硼酸吸收液，用于吸收氨氣，另一個裝有20 mL鋅銨絡鹽溶液，用于吸收硫化氫。大燒杯用雙層保鮮膜封口，靜置培養，第7天取出吸收液，利用硼酸吸收凱氏定氮法[7]和鋅銨絡鹽比色法[8]分別測定氨氣和硫化氫釋放量，每組重復試驗3次，取出后放置新的吸收液。處理組與空白對照組進行差異顯著性分析，計算氨氣與硫化氫的降解率，確定臭氣降解率較高的除臭菌株。

1.3.5 除臭菌株的鑒定

通過2次篩選試驗，對具有明顯抑制臭氣釋放的菌株進行形態觀察及分子鑒定。將菌懸液劃線到PDA培養基上，30 ℃恒溫培養48 h后，進行形態觀察。挑取菌落加入裝有PCR反應體系的PCR管中，進行16S rRNA基因擴增，然后將目的片段送至上海生工進行測序，所得結果在GeneBank上進行同源性比對分析，所用引物為原核生物16S rRNA PCR通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3.6 除臭效果檢測

稱取1 kg新鮮豬糞置于10 L大桶中，按照1%、3%和5%的接種量接種Z2菌液，上方放置2個100 mL燒杯，分別裝有50 mL硼酸吸收液和50 mL鋅銨絡鹽溶液，同時以加等量無菌水作為空白對照組，每組設3個重復。大桶用保鮮膜及塑料膜封口，室溫靜置培養，第7天和第14天分別測定氨氣和硫化氫的釋放量，與對照組進行分析，計算菌株對氨氣和硫化氫的降解率。

1.3.7 統計學分析

應用SPSS 18.0軟件對試驗數據進行統計分析，試驗數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 除臭菌株的初篩

經過氨氣和硫化氫選擇性培養基的富集馴化后，通過劃線法分離菌株，共分離得到12株可以同化氨氣或硫化氫的菌株(表1)，分別命名為Z1-Z4、S1-S5、Y3、Y6和GH。對分離得到的各菌株進行初步去除氨氣和硫化氫的試驗，根據感官篩選法，12株菌株中Z2的除臭能力最強，處理后惡臭強度級別為“0”；S1、Z3、Y3、Y6、GH的除臭能力次之，處理后惡臭強度級別為“1”。選擇S1、Z2、Z3、Y3、Y6、GH菌株進行復篩。

表1 除臭菌株的感官評級

2.2 除臭菌株的復篩

對初篩得到的6株除臭菌株進行復篩，計算第7天和第14天各菌株對氨氣和硫化氫的降解率，同時與商品菌劑(LD)的除臭效果作比較。

圖1結果可以看出，在初篩中表現出較好除臭能力的菌株在復篩實驗也有一定的除臭能力。大部分菌株對氨氣的降解率要高于對硫化氫的降解率；氨氣的降解率隨著時間的延長略有提高，硫化氫的降解率隨著時間的延長略有下降。菌株Z2、Z3和GH的除臭效果均優于商品化菌劑LD。綜合分析菌株對氨氣和硫化氫的降解率，菌株Z2的除臭效果最好。

圖1 除臭菌株的硫化氫、氨氣降解率

2.3 除臭菌種的鑒定

2.3.1 除臭菌株Z2的菌落形態特征

將Z2菌株劃線接種于PDA培養基中，30 ℃培養48 h。經恒溫培養后，長成0.5～1.0 mm白色菌落，菌落米黃色不透明，圓形低平，邊緣整齊，濕潤且扁平(圖2)。顯微鏡下觀察到菌體呈桿狀，形成芽孢(圖3)。

2.3.2 Z2菌株的16S rRNA基因序列分析

經16S rRNA基因序列分析，所獲得的高效糞污除臭菌株Z2與彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)的相似性水平達98%，結合細胞、菌落形態試驗結果，可基本確定Z2為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。

圖2 Z2菌落的形態特征

2.4 不同接種量對Z2菌株除臭效果的影響

如圖4所示，氨氣的降解率隨著時間的延長而提高，第14天時最高；硫化氫的降解率隨著時間的延長而下降，在第7天最高。接種量為1%～3%范圍內時，菌株對氨氣的去除率隨著添加量的增大而增大；菌株對硫化氫的降解率與接種量無關。

圖4 不同接種量對氨氣、硫化氫的降解效果

3 討論

畜禽養殖場的惡臭主要來源于畜禽糞污。本研究從養殖場的土壤和糞便采樣進行除臭微生物篩選，提高了篩選的概率和針對性。通過馴化富集得到了12株可以同化氨氣或硫化氫的菌株，經過初篩、復篩，獲得6株具備除臭能力的菌株，其中菌株Z2可以同時高效去除氨氣和硫化氫。通過對該菌株進行了鑒定，包括形態學觀察及16S rRNA基因分析，確定該菌株為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。采用小試試驗發現，該菌株對豬糞具有較好的除臭效果，且接種量僅需1%～5%，在畜禽糞污除臭方面具有較好的應用前景。同時可以耐受高溫的菌株，在堆肥實踐中具有較好的應用價值[9]，菌株Z2由于可以產生芽孢耐受高溫，因而其在堆肥中也可以應用。

畜禽糞污產生的臭氣成分復雜，單一菌株通常難以實現對多成分臭氣的高效去除，因而除臭菌群的篩選往往成為研究熱點[10]。本試驗得到的菌株Z2對氨氣和硫化氫均可以去除，但是小試結果發現，Z2對硫化氫的降解率隨著時間的延長有明顯的下降。因此，后續研究將篩選可以持續高效去除硫化氫的菌株，并與菌株Z2進行復配制備成高效的除臭菌劑，并對其作用機理進行深入的探討。