黃芩素對糖尿病大鼠胰島功能的影響及其機制探討

近年來，中國的糖尿病患病率不斷攀升，截至2013年，中國成年人糖尿病患病率已達10.4%[1]，即我國有1.4億糖尿病病人，位居全球第一，且仍有63%的糖尿病病人未得到診斷，嚴重危害人類健康。糖尿病不斷進展的重要原因是胰島β細胞功能進行性減退，而β細胞凋亡是導致2型糖尿病β細胞功能減退的重要原因[2]，因此抑制β細胞過度凋亡，成為治療糖尿病的關鍵要素。黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一，其具備很強的抗氧化作用[3]。而胰島β細胞容易受到氧化應激攻擊而發生凋亡，目前有關黃芩素的降糖、改善胰島功能的作用鮮有報道。本研究通過制備2型糖尿病大鼠模型，采用黃芩素干預治療，通過檢測大鼠外周血血糖、胰島素、胰腺組織膜脂過氧化產物丙二醛(malondialdehyde，MDA)及抗氧化物超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)、凋亡蛋白的表達變化，觀察黃芩素對2 型糖尿病大鼠的治療效果，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性Wistar 大鼠30只，體質量180～250 g，購至上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號碼SCXK(滬)2012-0002]。通過廈門大學附屬福州第二醫院動物倫理委員會審核(審批號2016-021)。

1.2 試劑及儀器 黃芩素(上海圖赫實業有限公司)； 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國Sigma 公司)；MDA檢測試劑盒 (山西澳瑞鑫生物科技有限公司)；胰島素檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒(天津易捷康科技發展有限公司)；血糖儀及試紙(美國雅培公司，FreeStyle Optium Neo H)；相關抗體cleaved Caspase-3、β-actin(美國CST公司)。儀器：TGL-16M低溫高速離心機(常州金壇良友儀器有限公司)，科華酶標儀ST-360(濟南來寶醫療器械有限公司)，DYY-6C型電泳儀(南京普陽科學儀器研究所)。

1.3 模型制備及分組 6周齡雄性Wistar 大鼠30只，適應性喂養1周后，采用隨機數字表法隨機抽出10只作為正常對照組(NC組)，余下20只為造模組。NC組普通飼料喂養，與造模組同步腹腔注射相應劑量的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液。

造模組高脂飼料喂養4周后，腹腔注射STZ(25 mg/kg)2 次，間隔1周；1周后檢測空腹血糖 (fasting blood glucose，FBG)，當FBG≥7.8 mmol/L時，模型構建成功，最終成模率為100%[4]。將已造模成功的20只大鼠再按隨機數字表法隨機分為兩組，糖尿病模型組(DM組)和黃芩素組(BAI組)，每組10只。開始給藥，每日09：00～10：00灌胃給藥1次，灌胃期間每4周斷尾測定血糖1次，連續灌胃8周。BAI組給予黃芩素250 mg/kg灌胃；NC組及DM組用相同容量的生理鹽水灌胃。

1.4 樣品收集 末次給藥后，麻醉大鼠，腹主動脈采血10 mL，采用注射麻醉法處死大鼠。留取全血，離心15 min后分離血清備用。分離胰腺，液氮速凍，而后轉至-80 ℃冰箱凍存。

1.5 FBG及空腹胰島素(FINS)檢測 FBG濃度采用血糖儀測定；采用ELISA法測定血清FINS。

1.6 胰腺組織中MDA及SOD檢測 取胰腺組織(1 g 左右)剪碎，研磨制成10%胰腺組織勻漿，離心，取上清液冷凍保存。分別按試劑盒說明書測定 MDA和SOD含量。

1.7 Western 印跡法檢測cleaved Caspase-3的表達 取大鼠胰腺組織蛋白1 g左右，加入RIPA裂解液，分離胰腺組織蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取等量蛋白電泳，同時PVDF膜印跡，室溫下封閉后，加入 cleaved Caspase-3一抗溶液，及標準內參β-actin，4 ℃孵育過夜，而后再加入HRP-山羊抗兔IgG二抗溶液，室溫孵育1 h，電化學發光顯色，Bio-Rad凝膠成像系統成像，Quantity-One測灰度值并分析。實驗重復4次，取平均值。

2 結 果

2.1 各組大鼠FBG、FINS水平比較(見表1) 與NC組比較，DM組FBG水平升高(P<0.05)，而FINS水平降低(P<0.05)；與DM組比較，BAI組的FBG水平降低(P<0.05)，而FINS水平升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠FBG、FINS水平比較(±s)

與NC組比較， 1)P<0.05；與DM組比較，2)P<0.05

2.2 各組大鼠胰腺SOD活性和MDA含量比較(見表 2) 與NC組比較，DM組SOD活性明顯下降(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)；與DM組比較，BAI組SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠胰腺SOD 活性和MDA含量比較(±s)

與NC組比較， 1)P<0.05；與DM組比較，2)P<0.05

2.3 各組大鼠胰腺組織凋亡蛋白cleaved Caspase-3蛋白表達比較(見圖 1、表 3) 與NC組比較，DM組cleaved Caspase-3表達升高(P<0.05)，而BAI組給予黃芩素治療8周后，cleaved Caspase-3表達顯著下降(P<0.05)。

圖1 各組大鼠 cleaved Caspase-3蛋白電泳圖

組別只數cleaved Caspase-3NC組100.96±0.15 DM組102.14±0.231)BAI組101.15±0.172)

與NC組比較， 1)P<0.05；與DM組比較，2)P<0.05

3 討 論

黃芩是著名的傳統中藥，黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一，其具備抗炎、抗氧化、清除氧自由基及抗腫瘤等作用[5]，其中以抗氧化作用尤為突出。黃芩素分子結構內含有3個羥基，因而它們具有一定的自由基清除活性。研究發現黃芩素對羥自由基、超氧陰離子( O2-)及烷過氧自由基有較強的清除作用[4]。

有研究表明，糖尿病的發生發展與氧化應激有密切的關系[6]。胰島β細胞對活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的變化非常敏感，而胰腺抗氧化物水平比較低(包括過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶)，因此，胰島β細胞容易受到氧化應激攻擊而出現損傷[7]。糖尿病持續的高血糖可致使胰腺組織產生大量ROS，而其抗氧化酶活性下降，胰腺組織氧化應激增強。MDA是膜脂過氧化重要的產物之一，膜脂過氧化的程度可通過MDA了解[8]。本研究中，DM組大鼠胰腺MDA顯著高于NC組大鼠，而SOD活性顯著下降，說明糖尿病大鼠胰腺組織中ROS生成增多，而抗氧化防御系統能力降低，胰腺組織受到氧化應激攻擊而損傷，從而影響胰島分泌功能。給予糖尿病大鼠黃芩素治療后，糖尿病大鼠血糖顯著下降，胰島素分泌增加，同時胰腺組織中MDA減少，SOD活性增加，說明黃芩素可抑制糖尿病大鼠胰腺組織中氧化應激，改善胰島β細胞的分泌功能，在一定程度上緩解了糖尿病大鼠的糖尿病癥狀。

在2型糖尿病高糖、高脂的狀態下，大量 ROS產生，不可避免地出現胰島β細胞的凋亡，引起胰島β細胞崩解。ROS可導致胰島β細胞線粒體膜的損傷，使其通透性增高，細胞色素C被釋放到細胞質中，激發胰島β細胞凋亡，從而導致靶組織損傷[9]。細胞凋亡主要有兩條通路： ①線粒體所介導的凋亡途徑(線粒體通路)，也被稱為細胞凋亡的內源途徑，如Bcl-2/Bax 凋亡途徑；②死亡受體通路，也被稱為細胞凋亡的外在途徑，主要通過細胞外信號激活細胞內的凋亡酶，包括Fas/Fasl 信號途徑和TNFR/TNF信號途徑。 兩條通路最終都激活Caspase-8、Caspase-9等凋亡啟動者，從而引起Caspase級聯反應[10-11]，進而使細胞內重要的結構蛋白和功能分子斷裂，引起細胞凋亡。已有的研究表明，Caspase-3 是細胞凋亡通路中一個重要蛋白酶，同時也是凋亡發生的標志酶[11]。在細胞凋亡中，Caspase-3是主要執行者，其活化時會被剪切生成活性片段cleaved Caspase-3，而后發揮蛋白水解酶作用而促進細胞凋亡，因此可以通過測定cleaved Caspase-3 大致反映細胞凋亡情況[12]。 本研究中，糖尿病大鼠胰腺的 cleaved Caspase-3蛋白表達明顯增強，而在給予黃芩素處理后可顯著抑制Caspase-3蛋白的表達，cleaved Caspase 3蛋白表達下降，提示黃芩素有降低胰島β細胞凋亡的作用。

綜上所述，黃芩素能降低糖尿病大鼠的血糖，并改善胰腺β細胞的胰島素分泌功能，其可能的機制是增強胰腺抗氧化的防御，減少氧化應激，最終抑制了cleaved Caspase-3的表達，從而使得β細胞凋亡減少。然而，黃芩素對胰腺β細胞的確切作用機制尚需進一步研究。