超高效液相色譜-串聯質譜法檢測扶正解毒散劑中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹

章安源,章安雯,牛華星,陳 玲*,張 琦

(1.山東省獸藥質量檢驗所，山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南 250022； 2.棗莊職業學院，山東棗莊 277100)

喹乙醇、乙酰甲喹屬于喹噁啉類合成抗菌藥，具有廣譜抗菌活性，促進動物生長。因此被廣泛地用作抗菌促生長劑和提高飼料轉化率制劑[1-3]；為保障動物產品質量安全，維護公共衛生安全和生態安全，農業農村部組織決定自2019年5月1日起，停止經營、使用喹乙醇等3種獸藥的原料藥及各種制劑[4]。

但鑒于少數不法獸藥企業在利益的驅動下，在清熱解毒類和促生長類獸用中獸藥散劑中違規添加。采用液相色譜法檢測喹乙醇，樣品前處理過程繁瑣,檢出限也較高,缺乏針對性的檢測方法，給養殖戶造成嚴重經濟損失；另一方面也會給人造成食源性細菌耐藥性等的潛在危害[5]。

研究參考了飼料殘留的檢測方法[6-7]，首次建立了扶正解毒散劑中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹的超高效相串聯質譜法，此方法可以作為非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的定性、定量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE-240電子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)；LC-30AD高效液相色譜儀(島津)，SCIEx四極桿帶電離噴霧源串聯質譜儀(AB公司)； KQ - 250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)；高速冷凍離心機(日立公司)，0.22 μm的濾膜為Waters 公司。

1.2 藥品及試劑 喹乙醇，批號H0061103，含量99.5%，乙酰甲喹，批號H0111008，含量99.6%，購自中國獸醫藥品監察所。甲酸、乙腈(色譜純，Merk，德國)；超純水。高純氮，高純氬(純度均為99.99%，濟南德陽氣體有限公司)。

1.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCR BEH C18色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動相A：乙腈；流動相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.4mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：35℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Progam of gradient elution

1.4 質譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描(ESI+)；多反應監測(MRM)；離子噴霧電壓：5500；離子源溫度：500 ℃；簾氣：20；霧化氣：50；加熱氣：50；測試藥物定性、定量離子對及對應的去簇電壓和碰撞能量見表2

表2 質譜測定參數

1.5 樣品制備

1.5.1 陰性樣品 扶正解毒散，來源：山東天利和生物工程有限公司；批號20181101。

1.5.2 標準儲備液的制備 精密稱取喹乙醇、乙酰甲喹10 mg(準確至0.01 mg)，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。-20 ℃冰箱保存，貯存期3個月。

1.5.3 樣品溶液的制備 精密稱取1.5.1項下扶正解毒散0.2 g，置30 mL離心管中，加20 mL 60%乙腈，40 ℃水浴超聲處理10 min，5000 r/min離心15 min，濾過，精密量取續濾液1 mL，置50 mL容量瓶中加初始流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得空白基質溶液。待測樣品以上法處理，作為UPLC-MS/MS供試品溶液。

1.5.4 基質匹配標準儲備溶液的制備 精密量取標準儲備液1 mL，置100 mL容量瓶中，加空白基質溶液稀釋至刻度，搖勻，從中精密量取1 mL置50 mL容量瓶中，加空白基質溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得100 ng/mL的基質匹配標準儲備溶液。

1.5.5 標準曲線的繪制 上述儲備液(1.5.2)用初始比例流動相稀釋，制成5、7.5、10、15、20、50、100、200ng/mL的溶液，并繪制標準曲線。

1.5.6 陽性添加樣品的制備 精密稱取16、20、24 mg喹乙醇、乙酰甲喹加入到陰性樣品中配制成80、100、120 μg/mL的陽性添加樣品，旋渦混勻，每種添加濃度制備3份平行樣，每份樣品至少進樣2次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 線性考察 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離各離子。上述儲備液(1.5.2)用初始流動性稀釋，配制成5、7.5、10、15、20、50、100、200 ng/mL的溶液，經高效液相色譜串聯質譜儀測定后，以標準溶液中喹乙醇、乙酰甲喹定量離子峰面積為橫坐標，標準溶液中相應的喹乙醇、乙酰甲喹濃度為縱坐標，繪制標準曲線。如圖所示喹乙醇、乙酰甲喹在5～200ng/mL的范圍內標準曲線方程分別為Y=0.0108X-26.509，Y=0.0032X-24.2282，其相關系數分別為R2為0.9984，R2為0.9995，線性良好。見圖1，圖2。

圖1 喹乙醇標準曲線Fig 1 Standard curve of olaquindox

圖2 乙酰甲喹標準曲線Fig 2 Standard curve of mequindox

2.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液2 μL，連續進樣6次。以峰面積計算，得出喹乙醇、乙酰甲喹的RSD分別是3.02%,2.16%。表明儀器精密度良好，符合檢測要求。

2.3 重復性試驗 同批供試品(批號為 20180201，山東某獸藥生物科技有限公司提供)，按1.5.6項下制備6份樣品溶液，喹乙醇、乙酰甲喹含量的RSD分別是2.92%,2.66%，說明該方法重現性好，含量穩定。

2.4 穩定性試驗 取1.5.6項下同一供試品溶液(批號：20180201)，室溫下每隔4 h連測6次，進樣體積2 μL，喹乙醇、乙酰甲喹峰面積RSD分別為0.88%，0.92%、0.85%，表明本制劑在制備后的24 h內成份較穩定。

2.5 檢測限和定量限 25 μg/mL喹乙醇、乙酰甲喹對照品溶液信噪比(S/N)≥3，確定為方法的檢出限。50 μg/mL喹乙醇/乙酰甲喹對照品溶液顯示信噪比(S/N)≥10，作為此方法定量限。

2.6 方法選擇性的驗證 選擇20個空白樣品，按照優化條件進行處理后上機測定，未發現有假陽性結果，表明該方法的選擇性良好。

2.7 回收率試驗 扶正解毒散中添加喹乙醇，乙酰甲喹，液質分離良好，無干擾，添加濃度80、100、120 μg/mL，批內批間變異系數均小于10%，陽性添加樣品的回收率在90%～103%見表3。

表3 回收率試驗結果(n=9)Tab 3 Result of recovery for olaquindo and mequindox

方法批內相對標準偏差<10%，批間相對標準偏差<10%。

空白樣品、對照溶液及陽性添加樣品的液相色譜-串聯質譜譜圖見圖3～圖5。

圖3 100 ng/mL對照溶液提取離子色譜圖Fig 3 Extraction ion chromatograms of the contrast solution

圖4 空白樣品特征離子質量色譜圖Fig 4 Extraction ion chromatograms of the blank sample

圖5 100 ng/mL陽性添加樣品特征離子質量色譜圖Fig 5 Extraction ion chromatograms of the positive added sample

3 討論與結論

3.1 流動相的選擇 實驗選擇甲醇(0.1%甲酸)和乙腈(0.1%甲酸)為流動相A，分別考察了甲醇-水體系和乙腈-水體系分離情況，摒棄了乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(12∶88)作為流動相[8-9]，降低了色譜柱因磷酸鹽易堵的風險。不斷調整流動相比列：甲醇和乙腈由30%下降到15%[10]，最終選擇了5%乙腈(0.1%甲酸)為流動相A，不僅能使喹乙醇、乙酰甲喹很好的分離，其特征離子質量色譜圖的峰形和分離度比好，而且降低了檢測成本，有機試劑使用量較少，保護了環境。

3.2 質譜條件的優化 選擇了多反應監測模式，正離子掃描，并不斷優化了質譜條件：對離子源溫度、去簇電壓，碰撞能量等參數進行優化，使藥物的離子化程度達到最佳狀態。計算結果采用外標法，標準曲線線性良好；樣品處理簡單，經過1000倍的稀釋，上機檢測雜峰極微，無干擾，分離度好。

3.3 樣品提取溶劑、處理方法及的選擇 為確保藥品中有效成分全部溶解，保證藥物臨床有效性，分別用甲醇、乙腈、60%乙腈、5%乙腈對不同批號的樣品稀釋并超聲提取。直接采用甲醇、乙腈溶解樣品，得到供試品溶液雜質成分多，采取HLB固相萃取柱凈化樣品[11]；過程繁瑣，上機后柱效差，所得目標峰峰型、分離度均不理想。樣品60%乙腈超聲提取15分鐘，離心后過濾上機，雜質干擾少，峰形對稱，喹乙醇、乙酰甲喹回收率較高。基質匹配標準溶液采用空白基質溶液定容，空白基質溶液在與喹乙醇、乙酰甲喹對照品相同保留時間處，均無色譜峰出現，證明在很大程度上基質效應小，實驗準確度高。

3.4 結論 喹乙醇、乙酰甲喹在獸藥質量標準中的質量控制方法主要為紫外分光光度法，專屬性不強，且中藥組分的干擾較大，故選擇高效液相色譜串聯質譜方法檢測中獸藥散劑中違規添加的喹乙醇、乙酰甲喹[10]；喹乙醇是一種基因毒劑、生殖誘變劑，具有致突變、致畸和致癌性。建立其它中獸藥單方或復方制劑的喹乙醇、乙酰甲喹的檢測方法，對保障人民健康，具有重要的實際意義。

綜上所述，MS串聯可解決扶正解毒散中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹的定性、定量問題，消除基質干擾，使檢測結果更為準確可靠。檢測限低，靈敏度高；適合批量樣品分析。其次運行時間短，比文獻HPLC方法節省了大量流動相[12-13]，經濟可行。為治理整頓中獸藥中添加違禁藥物，嚴厲打擊違法行為，提供了檢測依據。