黃芩苷對H6N6禽流感患鼠血液指標的影響

李衛鵬，姚紅艷，楊雪貞，馬衛紅，錢 林，歐德淵,陳 希

(貴州大學動物科學學院,貴陽550025)

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒引起多種動物感染的高度接觸性傳染病。2014年，我國首次發生H5N6亞型AIV感染人致死的案例[1]。研究表明H5N6亞型AIV可由H5N1和H6N6重組形成[2]，其中H6N6亞型AIV已經可以在小鼠體內進行有效復制且引發呼吸道炎癥病變，表明其可以感染哺乳動物[3-4]，所以對H6N6亞型AIV的防控對公共衛生具有重要意義。近年來，中藥抗病毒的研究逐漸受到人們的重視，黃芩苷是黃芩中主要的有效成分，具有抗菌、消炎抗病毒的作用[5]。黃芩苷的體外研究表明，黃芩苷達到一定濃度時，具有抑制流感病毒增殖的作用[6]。在黃芩苷的體內研究中，有研究表明黃芩苷可以減輕流感病毒引起的小鼠肺部損傷、延長小鼠存活時間，具有明顯的抗流感病毒作用[7]。研究擬探究不同濃度黃芩苷對感染鴨源H6N6亞型AIV的小鼠的血液指標的影響，為黃芩苷防控低致病性禽流感提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 昆明系小白鼠108只雌雄各半(6-8周齡、體重22.17±2.24g)購于重慶騰鑫生物技術有限公司。

1.1.2 試驗毒株 H6N6亞型禽流感病毒，來源于貴州省動物疫病研究室。

1.1.3 主要試劑及儀器 黃芩苷(山西玉寧生物科技有限公司，批號：YN-20180512)，磷酸奧司他韋(宜昌長江藥業有限公司，批號：H20055532)，EDTAK2抗凝管(江蘇康健醫療用品有限公司)，PE-6800VET三分類動物血細胞分析儀(深圳市普康電子有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將108只6～8周齡昆明系小鼠隨機平均分為6組：陰性對照組、病毒陽性組、西藥對照組、低劑量黃芩苷組、中劑量黃芩苷組、高劑量黃芩苷組(所有劑量均結合文獻依照《中藥藥理實驗方法》進行體表面積換算所得)[8-10]。各組小鼠在相同條件環境下隔離飼養，自由采食和飲水。并于攻毒3 d后開始治療，分別于治療后3、6和9 d(各組每次采取6只小鼠)采用頸靜脈放血法處死，用EDTAK2抗凝管采集血樣。

1.2.2 攻毒與治療 攻毒：陰性對照組尾靜脈注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只，其余各組均尾靜脈注射H6N6禽流感病毒(108EID50)0.2 mL/只。

治療：攻毒3 d后進行灌胃給藥，低劑量黃芩苷組(0.014 mg/只/d)，中劑量黃芩苷治療組(0.028 mg/只/d)，高劑量黃芩苷治療組(0.056 mg/只/d)，西藥治療組(0.39 mg/只/d)，病毒陽性組、陰性對照組每天給予等體積滅菌生理鹽水。

1.2.3 檢測方法 用血凝抑制試驗檢測實驗組攻毒效果；血液指標用PE-6800VET三分類動物血細胞分析儀測定108份小鼠血樣的血液指標。

1.2.4 數據統計 試驗所得的結果采用SPSS20.0軟件進行方差分析，數據用平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀 小鼠在攻毒3 d后，出現呼吸急促，食欲低下，精神萎靡，被毛粗亂、無光澤等癥狀，病理解剖發現肺臟出血(圖1)；病理組織學檢查發現黃芩苷治療組小鼠肺臟出血癥狀減輕(圖2-圖6)。

2.2 血清檢測 用血凝抑制試驗對試驗組小鼠的血樣進行血凝效價檢測，攻毒后3、6和9 d血凝效價均≥24，空白對照血凝效價均<24，表明攻毒成功。

2.3 血液常規指標變化

2.3.1 白細胞總數指標 由表1可知，治療3、6和9 d時，病毒陽性組白細胞總數均極顯著高于陰性對照組和西藥對照組(P<0.01)；高劑量黃芩苷組白細胞總數均極顯著低于病毒陽性組和低、中劑量黃芩苷組(P<0.01)，顯著高于西藥對照組(P<0.05)。

表1 各組小鼠白細胞總數指標(n=6)Tab 1 Total leukocyte number index of mice in each group (n=6)

同行數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P<0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05).The same as below.

2.3.2 中性粒細胞指標 由表2可知，治療3、6和9 d時，病毒陽性組中性粒細胞數目均極顯著高于陰性對照組和所有治療組(P<0.01)；高劑量黃芩苷組中性粒細胞數目均極顯著或顯著低于低、中劑量黃芩苷組(P<0.01或P<0.05)，治療3 d時，與西藥對照組差異不顯著(P>0.05)；治療3和6 d時，高劑量黃芩苷治療組中性粒細胞百分比均極顯著或顯著低于低、中劑量黃芩苷組(P<0.01或P<0.05)，與西藥對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖1 H6N6亞型禽流感患鼠肺臟出血圖Fig 1 Pulmonary hemorrhage map of H6N6 subtype avian influenza mice

圖2 病毒陽性組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 2 Lung tissue sections of mice infected with virus-positive group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C)were stained with HE×400.

圖3 低劑量黃芩苷治療組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 3 Lung tissue sections of rats in low dose baicalin treatment group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C) were stained with HE×400.

圖4 中劑量黃芩苷治療組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 4 Lung tissue sections of rats in middle dose baicalin treatment group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C)were stained with HE×400.

圖6 西藥對照組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 6 Lung tissue sections of rats in western medicine control group on day 3 (A),day 6 (B), day 9 (C)were stained with HE×400.

表2 各組小鼠中性粒細胞指標(n=6)Tab 2 Neutrophil indices of mice in each group (n=6)

2.3.3 淋巴細胞指標 由表3可知，治療3、6和9 d時，高劑量黃芩苷治療組淋巴細胞數目和淋巴細胞百分比均極顯著或顯著高于病毒陽性組、低劑量黃芩苷治療組和中劑量黃芩苷治療組(P<0.01或P<0.05)，與西藥對照組差異不顯著(P>0.05)。

表3 各組小鼠淋巴細胞指標(n=6)Tab 3 Lymphocyte indices of mice in each group (n=6)

2.3.4 紅細胞指標 由表4可知，在治療3、6和9 d時病毒陽性組紅細胞數目均極顯著低于所有治療組(P<0.01)，治療3和9 d時黃芩苷治療組與西藥對照組、陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，治療6 d時，高劑量黃芩苷組與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)；在治療3、6和9 d時，所有黃芩苷治療組血紅蛋白濃度和平均紅細胞血紅蛋白含量均極顯著高于病毒陽性組(P<0.01)，與陰性對照組合西藥對照組差異不顯著(P>0.05)。

表4 各組小鼠紅細胞指標(n=6)Tab 4 Erythrocyte indices of mice in each group (n=6)

2.3.5 血小板指標 由表5可知，在治療3、6和9 d時病毒陽性組血小板數目均極顯著高于陰性對照組和所有治療組(P<0.01)，在治療3 d時，所有黃芩苷治療組與陰性對照組均差異不顯著(P>0.05)，在治療6和9 d時，低劑量、高劑量黃芩苷組與陰性對照組、西藥對照組均差異不顯著(P>0.05)，所有治療時段中，各組血小板壓積均差異不顯著(P>0.05)。

表5 各組小鼠血小板指標(n=6)Tab 5 Platelet indices of mice in each group (n=6)

3 討論與結論

3.1 黃芩苷可抑制H6N6亞型AIV感染小鼠的白細胞總數升高 在禽流感引起的病毒性炎癥中，白細胞參與炎癥的不同階段。在H6N6亞型AIV入侵動物機體時，機體會產生免疫應答反應，產生炎癥，其顯微變化主要表現為肺炎、支氣管炎等[11]。白細胞在炎癥發生時，通過滲出、趨化性和吞噬作用等方式對機體進行保護。在趙維波[12]等人研究中，靜脈注射禽流感病毒3 d后，小鼠白細胞總數、粒細胞數目均顯著高于正常值。本試驗小鼠感染H6N6亞型AIV后，治療第3、6和9 d時病毒陽性組白細胞總數、中性粒細胞數目均極顯著高于陰性對照組的結果也印證了這一點，根據血凝抑制試驗結果和血液指標檢測，表明造模成功。

在中藥抗病毒的過程中，有直接作用和間接作用[13]。孫鸝[14]等研究發現，白細胞需要細胞黏附因子的參與，才能夠通過微血管壁進入炎區。解曉霞[15]等的研究表明，黃芩苷能夠抑制CD54、CD106、TNF-α、可溶性CD54的表達，從而抑制血管內皮細胞黏附因子的表達，降低炎性反應。黃芩苷可以通過抑制黏附因子的表達，從而降低白細胞滲出的數量，減少白細胞的聚集，從而可以減少白細胞所釋放的酶類、炎癥介質等引起或者加劇組織損傷。萬巧鳳[16]等的研究結果表明，黃芩苷可以通過抑制流感病毒感染的轉錄因子AP-1的高表達，從而降低炎性細胞的分泌，從而緩解炎癥的病理損傷。本試驗中黃芩苷治療可有效抑制可抑制H6N6亞型AIV感染小鼠的白細胞總數升高，推測可能是黃芩苷通過抑制炎性因子的產生從而使減少白細胞的產生。

3.2 黃芩苷可降低禽流感患鼠的中性粒細胞數目

中性粒細胞在機體防御和抵抗病原侵襲過程中起著非常重要的作用，常見于急性炎癥初期[17]。在禽流感病毒進入靶細胞的過程中，HA2亞基起到介導病毒遺傳物質釋放到細胞中的作用[18]。中性粒細胞需要通過趨化、黏附和吞噬等方式實現對機體的保護，此時不僅大量出現在炎區，外周循環血液中的數量也會增多[19]。

在本試驗中，黃芩苷治療組中性粒細胞數目均極顯著低于病毒陽性組。楊潔[20]等人研究發現，黃芩苷可以通過抑制血凝素HA2亞基的活性，降低病毒遺傳在細胞中的復制，從而抑制流感細胞對機體的侵入，這可能也是中性粒細胞數目降低的原因。

3.3 黃芩苷可升高禽流感患鼠的淋巴細胞數目 淋巴細胞常見于慢性炎癥、炎癥恢復期、病毒性炎癥過程中，具有與抗原發生特異性反應的能力，其中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群在動物外周血中的分布量以及CD4+/CD8+的比值是重要的免疫狀態檢測指標[21]。譽鐵歐[22]等通過對人感染H7N9禽流感流行病學研究發現，流感病毒攻擊機體后淋巴細胞數目降低，T淋巴亞群降低等免疫失衡的現象。本試驗治療3、6和9 d時，病毒陽性組淋巴細胞數目均極顯著低于陰性對照組這一結果也印證了這一點。薛洋[23]等研究發現，黃芩苷可以使傳染性支氣管炎患雞雞外周血內CD3+、CD8+T淋巴細胞顯著增加，這與本試驗黃芩苷治療組淋巴細胞均極顯著高于病毒陽性組的結果一致。

3.4 黃芩苷可以減少炎癥中出血反應 在流感病毒侵襲動物機體的過程中，紅細胞和血紅蛋白的減少，常見于機體失血性貧血[24]，血小板數目的升高，預示著有炎癥損傷或內臟器官出血或淤血[25]。在止血的過程中，血小板與纖維蛋白原的關系既是促進，又是抑制。在凝血環節PF2促進纖維蛋白原轉變為纖維蛋白單體，加速凝血，減少紅細胞從血管滲出，到了血栓后期，隨著血小板解體和釋放反應增加，釋放纖溶酶原激活物，直接參與纖維蛋白溶解[26]。黃芩苷有強的抑制血小板聚集的作用，并能抑制纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，因而有抗凝血作用，通過減少血小板的聚集從而減輕炎癥中組織器官淤血情況。本試驗中治療6d和9d時，中、高劑量黃芩苷組紅細胞數目較病毒陽性組均極顯著上升，所有治療時段黃芩苷治療組較病毒陽性組血小板總數均顯著降低這一結果也印證了這一點。

3.5 結論 試驗通過檢測不同濃度黃芩苷治療感染H6N6亞型禽流感病毒患鼠的血常規指標，與陰性對照組、病毒對照組、西藥治療組的血液指標進行對比，表明黃芩苷在較高濃度時對H6N6禽流感引起的炎癥反應中，具有降低白細胞總數，抑制出血反應的作用。但由于黃芩苷水溶性差的特點，對于黃芩苷抗病毒的最適濃度，還需有待進一步的研究，以便對其更好的開發與利用。