安琪根霉曲在小曲清香型白酒釀造生產中的應用分析與探討

潘天全，程 偉，張 杰，李 娜，彭 兵，鞏子路，吳麗華，吳宏萍

（1.安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽 236023；2.安徽金種子集團有限公司檢測中心，安徽阜陽 236018）

隨著科技的發展，社會物質生活豐富，白酒作為嗜好性食品，演變發展到目前多酒種、多香型共存的狀況。目前，我國白酒有濃香型、醬香型、清香型、兼香型、米香型、鳳香型、芝麻香型、豉香型、特香型、董香型、老白干香型和馥郁香型十二大類香型；其中，小曲清香型白酒是我國白酒釀酒歷史上最古老的酒種之一[1]。固態法小曲清香型白酒是中國蒸餾白酒的重要組成部分，以糧谷為主要釀造原料，小曲為糖化發酵劑，經蒸煮攤晾、培菌糖化、續糟發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，其出酒率高、發酵周期短，以乙酸乙酯為主體香，其風味特點是“清香純正、自然協調、醇甜柔和、后味爽凈”等[2]。霉菌在各類酒曲中都普遍存在，是我國酒曲微生物的重要組成部分。霉菌具有糖化力強的特點，并能產生多種影響酒類風味的物質，在白酒發酵過程中發揮著重要作用。常用于白酒釀造的霉菌主要包括：根霉屬(Rhizopus)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)、犁頭霉屬(Absidia)、青霉屬(Penicillium)等[3]；其中，根霉屬作為一種糖化力極強的霉菌，廣泛存在于各種酒曲中。根霉作為極其重要的釀酒微生物，其在糧醅糖化過程中的作用十分顯著。目前，關于根霉產酶特性的研究較多，純種根霉制曲已廣泛應用于釀酒生產，根霉在我國酒類釀造業中的作用已無可替代。在固態法小曲清香型白酒發酵中使用根霉曲，可進一步提高發酵效率，提高出酒率，提高原酒中乙酸乙酯的含量，增酯降醇，提高小曲酒質量，從而提升產品競爭力。本文結合生產實踐，對安琪根霉曲在小曲清香型白酒釀造生產中的應用進行了分析與探討，以期為根霉曲在白酒釀造生產中的應用提供借鑒依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣品與材料：發酵糧醅等取自正常生產的固態小曲清香型白酒釀造車間；根霉曲，湖北安琪酵母股份有限公司生產；清香型小曲，企業制曲車間生產。

儀器與設備：安捷倫7820B 型氣相色譜儀、安捷倫氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，5975C+7890A，EI 源）等；不銹鋼發酵箱（自制）、酒醅取樣器（自制）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

操作要點：（1）原料處理：優質高粱，無霉變，無蟲蛀等，用溫水浸泡20～24 h 后，濾水后投入壓力蒸料鍋清蒸；（2）蒸糧：根據原料特性及蒸煮糊化效果，一般初蒸15～20 min，敞蓋燜水50～55 min 后，再復蒸30～40 min；（3）培菌糖化：待蒸熟的物料揚散冷卻至30 ℃左右接入清香型小曲、安琪根霉曲等作為試驗組，對照組接入清香型小曲；同時，堆積糖化床平鋪清蒸后的稻殼，再平鋪糧醅進行堆積培菌糖化，并控制溫度、通風、時間等條件；（4）入箱發酵：糧醅培菌糖化后拌入原料總質量2～3 倍的新鮮糟醅，混合均勻后通風降溫至22～24 ℃，投入發酵箱密封發酵15 d，蒸餾取酒。

1.2.2 根霉曲的生產應用

試驗組：向培菌糖化的清香型糧醅中添加原料總質量1.0 %的清香型小曲，再添加原料總質量0.5 %的安琪根霉曲。對照組：向培菌糖化的清香型糧醅中添加原料總質量1.0 %的清香型小曲，不添加安琪根霉曲。

1.2.3 取樣及分析檢測方法

1.2.3.1 糧醅的取樣及處理方法

選擇堆積糖化床的前、中、后等3 個位置段的中央位置，糧醅表層10 cm 左右的深度（中層位置）作為取樣點，并在糧醅堆積開始及結束的時間點分別取樣，樣品取回后混合均勻并及時處理分析。分別采用烘干法測定水分含量，浸泡滴定法測定酸度，斐林試劑法測定還原糖含量。

準確稱取15 g 糧醅放入300 mL 的三角瓶中，用量筒準確量取150 mL 無水乙醇倒入三角瓶中，搖勻后浸泡24 h 再進行蒸餾處理，用量筒準確收集前蒸餾液100 mL 備用。取收集的80 mL 蒸餾液采用二氯甲烷液對酒樣進行萃取，V（二氯甲烷）∶V（酒樣）=1∶1，重復3 次萃取，經中低溫加熱并抽真空除去液體中的二氯甲烷，使樣液濃縮至5 倍進行GC-MS 檢測分析；另外，取收集的20 mL 蒸餾液進行氣相色譜分析。

1.2.3.2 發酵酒醅的取樣及處理方法

發酵酒醅每間隔1 d 取樣，發酵周期為15 d，采用發酵箱對角線上取兩角和中心3 個取樣點，每點再分別取發酵箱上層、中層、底層3 個取樣點，樣品取回后混合均勻并及時處理分析。

發酵酒醅樣品與糧醅樣品的GC-MS分析前處理方法相同。

1.2.3.3 揮發性風味成分的GC-MS分析方法

載氣為氦氣（99.999 %），柱流速1.0 mL/ min；初始溫度40 ℃，保持12 min；以3 ℃/ min 升至108 ℃，保持2 min；再以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。進樣量1.0 μ L，采用分流進樣，分流比50∶1，進樣口溫度250 ℃。質譜條件：離子源溫度230 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描質量范圍45～550 amu，檢索譜庫為NIST 質譜數據庫，溶劑延遲1.0 min。

1.2.3.4 氣相色譜分析條件

配有氫火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜儀，白酒分析專用填充柱（柱長2 m），氫氣流速30 mL/min、氮氣流速40 mL/ min、空氣流速300 mL/ min，柱溫90 ℃、等溫，進樣器溫度150 ℃，檢測器溫度150 ℃。

1.2.3.5 原酒分析

統計發酵原酒的產量、酒精度等，采用氣相色譜法檢測主要風味物質的含量，酸堿滴定法檢測總酸含量，蒸餾-皂化法檢測總酯含量。對比相關指標變化，計算乙乳比等，并結合品評意見等因素，綜合分析安琪根霉曲在小曲清香型白酒釀造生產中的應用效果。

2 結果與分析

2.1 根霉曲的應用工藝分析與探討

2.1.1 釀酒小曲的制備

小曲作為糖化發酵劑被廣泛應用到釀造黃酒和小曲酒中，傳統小曲制備多是使用米粉、米糠或麩皮等，有的添加一些中草藥，或者少量白土（觀音土），再接入種曲，加入適量水制成曲坯或曲團，在合適的溫度和濕度下培養而成，因其曲塊體積較小，習慣上稱為小曲[4]。金種子傳統小曲的制備工藝采用生料制曲，以麩皮等為主要原料，配料混合均勻加入50%～60%的水，添加活化后的根霉、生香酵母和酒精酵母等，翻拌均勻后入室培養。冬季小曲曲坯表層可加蓋草簾，夏季表層可加蓋紗布防止雜菌感染，同時防止水分揮發。入室培養第2 天根據小曲升溫情況進行翻曲，曲坯入室培養5 d 左右即可出室，40 ℃通風干燥或晾曬粉碎后使用。采用純種根霉和酵母進行培菌制曲，與其他傳統小曲比較，純種制曲具有用曲量少、出酒率高、酒質穩定等特點。

2.1.2 根霉曲及其生產應用

根霉既能產糖化酶，也能產液化酶（α-淀粉酶），根霉產糖化酶的能力更強且活性高，能將淀粉充分轉化為葡萄糖。研究表明[5-6]，根霉比較“嬌嫩”，生長速度慢,多數根霉最適生長溫度為30～33 ℃，酶生成溫度比生長溫度略高，最適產酶溫度在33～35 ℃；根霉對含水量要求較高，水分過高或過低都不宜于根霉的生長繁殖，根霉的最適生長環境含水量為52%～54%。隨著純種制曲技術的發展與應用，當前，以麩皮為原料的純種根霉曲在小曲酒釀造生產中得到廣泛使用[7]。根霉曲的制備工藝決定著根霉曲的質量標準，安琪酵母公司生產的根霉曲采用液固培養法工藝，斜面菌種經三級純種液態擴大培養，固態通風培養，快速低溫干燥等制備，以麩皮等為載體，粉末狀至不規則顆粒狀，顏色近似麥麩，色質均勻一致，無雜色，具有根霉曲特有的曲香，無霉雜氣味等。安琪根霉曲水分≤10 %，陰涼干燥處保存保質期為12 個月。小曲白酒釀造工藝具有用曲量小、發酵周期短、出酒率高、生產設備簡易、成本低廉、適合于機械化生產等特點。傳統小曲采用自然接種培養制備，成品小曲不僅含有根霉、酵母等釀酒功能菌，而且還含有各種雜菌；因雜菌的存在會導致出酒率下降、酒質不穩定等弊端。

本研究對傳統的小曲清香型白酒釀造工藝進行調整，將根霉曲應用到小曲清香型白酒的培菌糖化過程中，以配合小曲微生物參與糧醅的培菌糖化過程。根霉有一定的產酒精的作用，能邊糖化邊發酵的過程中產生乳酸、琥珀酸、蘋果酸和延胡索酸等有機酸；此外，在一定條件下根霉還能產生如乙醛、乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸、苯乙醇等風味物質[8]。合理有效地添加根霉曲能夠抑制培菌糖化及發酵過程中有害雜菌的生長，提高曲料的酒化能力，增加與豐富酒體風味成分、改善口感等，保證了酒體風格，對提高出酒率起到積極作用。

2.1.3 小曲清香型白酒的釀造生產工藝（圖1）

小曲清香型白酒以糧谷為主要釀造原料，小曲為糖化發酵劑，經蒸煮攤晾、培菌糖化、續糟發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，其具有出酒率高、發酵周期短、醇香清雅、糟香突出、回味協調、余味爽凈等特點。泡糧后的高粱經過回收蒸汽預熱約10 min，預熱后進入連續蒸煮機帶壓初蒸，初蒸時間控制在15～20 min，初蒸結束后進入隧道式連續燜水機直接燜水，燜水時間由高粱品種而定，燜水后糧粒連續出料后，再次入連續蒸煮機復蒸30～40 min。在線控制初蒸壓力、初蒸時間、燜水溫度、燜水時間、復蒸壓力、復蒸時間等，糧食蒸煮后，可達到較好的糊化效果[9]。在糧醅糖化過程中糖化酶活力整體呈先上升后下降的趨勢，當糖化溫度為30～33 ℃時，其糖化酶活力最大，即糖化酶活力主要與糖化糧醅的溫度有關，在酵母菌、根霉菌的最適宜生長溫度時，酶活力達到最大[10]。因此，應嚴格控制糧醅培菌糖化工藝，其中，糧醅的水分、酸度、蒸料效果等，以及培菌糖化的溫度、通風、時間等直接關系到糖化效果，進而影響出酒率與產酒風格。

應用根霉曲的釀造工藝調整后，在加入小曲的基礎上再加入根霉曲，并控制糧醅的含水量，培菌糖化溫度達到30～33 ℃，時間在20 h 左右，即可配糟入箱密封發酵。培菌糖化后拌入原料總質量25 %左右的新鮮糟醅，混合均勻后通風降溫至22～24 ℃，投入發酵箱密封發酵15 d 左右，即可出箱蒸餾取酒。糧醅入箱發酵過程中，應及時檢查發酵容器的密封性，并觀察發酵溫度變化，或采用發酵間集中放置發酵箱并控制溫度等方法實現發酵溫度的控制[11]。

2.2 糧醅培菌糖化效果及其揮發性風味成分分析

2.2.1 糧醅培菌糖化效果比較（表1）

表1 糧醅培菌糖化效果比較

小曲清香型白酒的釀造生產原料主要為高粱，采用堆積培菌糖化工藝，其使用的根霉曲具有邊生長邊糖化等作用，在淀粉向還原糖轉化過程，可增加糧醅的酒香與復合香。由表1 可知，試驗組糧醅培菌糖化后還原糖和酸度等理化指標均比對照組高，還原糖含量比對照組高20%左右，培菌糖化后的糧醅聞香優于對照組，表明根霉曲在糧醅培菌糖化過程中有協同傳統小曲進一步促進糧醅糖化的作用。

圖1 小曲清香型白酒的釀造生產工藝流程

2.2.2 糧醅培菌糖化前后揮發性風味成分分析（圖2）

圖2 糧醅培菌糖化后的GC-MS揮發性風味成分分析譜圖

HS-SPME 技 術、GC-MS 技 術、GC×GCTOFMS 技術等現代分析技術在白酒香味成分的定性和定量分析研究上廣泛應用。由圖2 可知，應用GC-MS 技術分析糧醅培菌糖化后試驗組的色譜峰比對照組的色譜峰要多，表明試驗組糧醅中揮發性風味成分的種類較豐富。由表2 可以看出，試驗組或對照組糧醅堆積后的揮發性風味成分都比堆積前要多，可表明，糧醅在培菌糖化前期所接種的微生物代謝活動較弱，糧醅在培菌糖化過程中，所接種的微生物代謝活動逐漸增強促進了風味物質的生成。

由表2 可知，試驗組中酯類物質11 種，醇類物質4 種，酸類物質3 種，其他類物質2 種；對照組中酯類物質9 種，醇類物質3 種，酸類物質2 種，其他類物質2種；糧醅培菌糖化前含酯類物質9種，醇類物質未檢出，酸類物質2種，其他類物質2 種。試驗組與對照組在培菌糖化后都產生苯乙醇等醇類物質，可能是由于在培菌糖化的過程中，某些細菌將葡萄糖發酵產生酒精，生成的醇類物質；試驗組中的酯類物質多于對照組及糧醅培菌糖化前，表明試驗組所添加的根霉曲對培菌糖化過程中的酯化反應有促進作用，同時根霉也具有代謝產酸產酯能力。試驗組中的酸類物質多于對照組及糧醅培菌糖化前，可能是由于根霉在生長過程中產生檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、琥珀酸等有機酸所致[12]。

2.3 酒培發酵過程中主要理化指標的檢測與結果分析

2.3.1 酒醅中乙酸乙酯、乳酸乙酯等的含量變化

酯類是一類具有特殊芳香性氣味的化合物，是白酒中重要的芳香類物質，主要起呈香作用，可以在不同程度上增加酒的香氣，決定酒香氣的品質，對白酒香型確定起著重要作用。小曲清香型白酒中主要呈香物質為乙酸乙酯和乳酸乙酯等；其中，乙酸乙酯又稱醋酸乙酯，沸點為77 ℃，感官閾值為17.00 mg/L，具有蘋果樣香氣，味刺激帶澀，味短[13]。由圖3 可知，試驗組與對照組中乙酸乙酯的含量在發酵過程中整體呈上升趨勢，其在發酵1～4 d 時上升的幅度較大，4～11 d 時含量基本穩定，11～15 d時又有所上升；糧醅發酵15 d 時出池，試驗組中乙酸乙酯的含量為24.5 mg/L，對照組中乙酸乙酯的含量為20.3 mg/L，試驗組中乙酸乙酯的含量是對照組的1.21 倍，發酵結束時，試驗組中乙酸乙酯的含量明顯高于對照組。

乳酸乙酯為無色液體、略有氣味，是清香型白酒中主要的香味物質之一；其含量適當，即乳酸乙酯與乙酸乙酯比例恰當，會使清香型白酒的酒體柔和協調，反之，則會使酒體苦澀不協調。任道群等[14]的研究表明，根霉在對混合酸與乙醇的催化過程中，對乳酸乙酯的生成有一定的作用。由圖3 可知，試驗組與對照組中乳酸乙酯的含量均呈明顯上升趨勢，發酵1～5 d時，對照組中乳酸乙酯含量要比試驗組中略高，發酵5 d以后，實驗組中乳酸乙酯含量比對照組中高；糧醅發酵15 d 時出池，試驗組的乳酸乙酯含量為25.7 mg/L，對照組中乳酸乙酯的含量為20.7 mg/L；試驗組的乳酸乙酯含量是對照組的1.24倍，發酵結束時，試驗組中乳酸乙酯的含量明顯高于對照組。

表2 糧醅培菌糖化前后試驗組與對照組GC-MS揮發性風味成分分析結果

圖3 小曲清香型白酒發酵酒醅中乙酸乙酯、乳酸乙酯等含量的變化

2.3.2 酒醅中異戊醇、雜醇油等的含量變化

醇類化合物是清香型白酒中重要的呈味物質，也是此類酒中總含量最高的一類風味成分。在醇類化合物中，正丙醇、異戊醇、異丁醇、仲丁醇等的含量較高，清香型白酒的口味特點是入口微甜，刺激性較強，帶有一定的爽口苦味等，這很大程度上與醇類化合物的含量及比例有直接關系。正丙醇在一定濃度范圍內，口味會出現類似清香型小曲酒落口干爽帶苦的特點，若濃度過低將不會出現這種口味特征[15]。影響白酒口味的成分不可能是一種成分，白酒口味還受到其他組分的共同影響。在清香型小曲酒特定組分構成條件下，正丙醇及其他醇類(異戊醇、異丁醇、仲丁醇)確實形成了清香型小曲酒的特殊口味特征。由圖4 可知，試驗組與對照組中正丙醇的含量均整體呈上升趨勢，發酵1～3 d對照組中正丙醇含量高于試驗組，發酵5～11 d 實驗組與對照組中正丙醇含量交替上升；糧醅發酵15 d 試驗組與對照組中正丙醇含量趨于相近；酒醅出池時試驗組中正丙醇的含量為8.37 mg/L，對照組中正丙醇的含量為8.43 mg/L。

圖4 小曲清香型白酒發酵酒醅中正丙醇、雜醇油等的含量變化

雜醇油有時也泛指高級醇，是一類高沸點的混合物，通常為淡黃色至棕褐色的透明液體，是具有揮發性的特殊香味物質。雜醇油主要成分包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、正戊醇、異戊醇等，少量雜醇油可構成白酒的不同風格。如果白酒中沒有雜醇油或其含量過少，酒味將會十分淡薄；如果含量偏高，就會使酒產生苦味或澀味，過量攝入雜醇油也會對人體造成危害[16]。由圖4 可知，試驗組與對照組中雜醇油的含量均整體呈上升趨勢，發酵1～3 d 試驗組中雜醇油含量高于對照組，發酵3～5 d 對照組中雜醇油含量高于試驗組，發酵5～15 d 試驗組中雜醇油含量高于對照組；酒醅出池時，試驗組中雜醇油的含量為4.03 mg/L，對照組中雜醇油的含量為3.86 mg/L，表明糧醅發酵結束時試驗組中雜醇油的含量略高于對照組。

2.4 原酒色譜指標的檢測與結果分析（圖5）

圖5 根霉曲釀造小曲清香型白酒的原酒色譜指標對比分析

優質清香型白酒的基酒中，主體香味成分乙酸乙酯的含量較高，乳酸乙酯含量僅次于乙酸乙酯，這是清香型白酒香味組分的重要特征。乙酸乙酯和乳酸乙酯的絕對含量及兩者的比例關系，對清香型白酒的質量和風格特征起到重要影響。一般乙酸乙酯與乳酸乙酯的含量比例為1∶0.6～0.8，若乳酸乙酯含量超過這個比例濃度，將會影響清香型白酒的風味[17]。由圖5 可知，試驗組中的乙乳比為1.92，對照組中的乙乳比為1.42，乙乳比從1.42提高到1.92，對小曲清香型白酒的品質有重要提升作用。

以上各成分色譜指標含量均為原酒降低酒精度到58%vol 時的檢測結果，產酒數據統計結果表明，應用根霉曲釀造工藝調整后，積極協同促進了糧醅的培菌糖化效果，原料出酒率有所提高，表明糧醅的培菌糖化工藝及其效果與原料出酒率密切相關。由圖5 可知，試驗組中乙酸乙酯的含量約為對照組的1.10 倍；試驗組中甲醇、正丙醇、雜醇油等的含量與對照組差別不大，試驗組中總酸含量略高于對照組，試驗組中總酯的含量略高于對照組。與對照組對比表明，試驗組中原酒的乙酸乙酯含量提高9.8%，總酯含量提高7.1%，總酸含量提高7.8%，乙乳比由1.67 提高到2.38，原酒香味更加豐富協調，清香純正、突出，從而實現了原酒品質的進一步提升。

3 討論與總結

根霉曲包括根霉甜酒曲和根霉酒曲，根霉甜酒曲以根霉為菌種，經固態或液態純種培養而成，通常用于糯米或其他糧食原料釀制甜酒，以供直接食用。根霉酒曲在純根霉曲中按一定比例加入純酵母，主要用于以大米、玉米、高粱等糧食原料配制小曲酒[18]。白酒香型分類的影響因素主要包括：用曲、工藝、發酵容器、風味物質等因素，根據風味物質的種類和含量差異確定不同香型，酯、醇、醛、酸等是其中最為重要的成分，根霉對這些物質的生成都有一定的影響。小曲清香型白酒與大曲清香型白酒或其他香型白酒相比，風味物質的種類較少、含量較低，其酯類物質的含量具有較大的提升空間。為提高小曲清香型白酒的品質，本文對安琪根霉曲在小曲清香型白酒釀造生產中的應用進行了分析與探討。結果表明，在小曲清香型白酒原生產工藝的基礎上添0.5 %的安琪根霉曲，與對照組相比，糧醅培菌糖化后揮發性風味成分的種類有所增加，尤其是酸類和酯類物質增加明顯，根霉曲配合小曲使用積極協同促進了糧醅的培菌糖化作用，酒醅中的乙酸乙酯、乳酸乙酯等風味物質含量變化對比明顯，原酒中乙酸乙酯含量提高9.8%，總酯含量提高7.1 %，總酸含量提高7.8 %，乙乳比由1.42 提高到1.92，原酒風味協調，清香純正、突出，從而提高了原酒品質。