花椒cpSSR標記開發及在種間、種內的通用性分析

李思巧，韋 伊，劉洪妤，張志東，張 野，王麗華，劉玉林

（1.西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌712100；2.四川省林業科學研究院 生物技術與良種研究所，四川 成都 610081）

簡單序列重復（SSR）廣泛分布于真核生物的核基因組，葉綠體基因組以及線粒體基因組中，常指一類以1～6個核苷酸為重復基元的串聯重復DNA序列［1］。因其分布廣泛、多態性高且具共顯性，SSR標記被廣泛開發和應用于種質資源鑒定與遺傳多樣性分析［2-3］。在植物中，由于葉綠體基因組表現為母系遺傳，以半保留方式進行自我復制，幾乎不發生重組，保守性遠高于核基因組。因此，葉綠體基因組中的SSR標記（chloroplast SSR，cpSSR）可在更高分類水平上進行種間、種內鑒定和遺傳進化分析［4］。隨著高通量測序技術的發展，大量植物的葉綠體基因組被測序與公布，相應的葉綠體SSR也得到了廣泛的開發與應用［5-7］。花椒Zanthoxylum bungeanum是蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum植物，其果皮曬干后是中國傳統的調味料和中草藥。在市場上流通的花椒果皮主要來自于花椒Z.bungeanum（又稱紅花椒或大紅袍花椒）和竹葉花椒Z.armatum（又稱青花椒），而在日本主要利用日本花椒Z.piperitum（又稱胡椒木或朝倉花椒）進行麻味物質和其他藥用活性成分的提取分析［8］。在前人的研究中，基于核基因組內部序列差異開發的 SCAR（sequence-related amplified polymorphism）標記［9］、 ISSR（inter-SSR）標記［10］和 ESTSSR（expressed sequence tags-SSR）標記［11］等已利用到花椒屬植物的遺傳分析中，而cpSSR標記在花椒屬植物的開發與應用還未見報道。鑒于此，本研究對花椒cpSSR位點進行篩選，分析其分布特點并利用花椒、竹葉花椒和日本花椒種質資源開發多態性標記，以期為花椒屬植物的種質資源鑒定、遺傳進化分析等提供可靠的標記資源。

1 材料與方法

1.1 SSR位點搜索與引物設計

基于本研究前期獲得的花椒葉綠體基因組序列［12］，利用TRF（tandem repeats finder）在線軟件（http://tandem.bu.edu/trf/trf.html）搜索單核苷酸重復序列，設置重復數≥10次；利用SSRHunter軟件［13］搜索核苷酸重復數位為2，3，4，5的SSR位點，對應重復數設置為5，3，3，3次。合并2種軟件的檢測結果，統計1～5 bp核苷酸重復所在花椒葉綠體基因組中的位置：長單拷貝序列區（LSC）、短單拷貝序列區（SSC）和2個反向重復序列區（IR）。SSR引物利用Primer3軟件（http://primer3.ut.ee）設計。原則為：擴增片段為150～250 bp；引物長度為18～22 bp；退火溫度為57～63℃；GC質量分數為30%～55%。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 種質資源采集與DNA提取

本研究共選用16份花椒屬種質資源進行SSR多態性的篩選，其中包括來自中國四川省和重慶市的5份竹葉花椒種質資源和1份日本花椒種質資源（均采自四川省林業科學研究院生物技術與良種研究所花椒種質圃）以及來自四川、貴州、陜西、山東和山西等5個省的10份花椒種質資源（均采自西北農林科技大學鳳縣花椒試驗示范站）進行多態性的篩選（表1）。所有種質資源選取3株，取鮮嫩葉片混合，硅膠干燥，常溫保存備用。

供試種質資源全基因組DNA利用 “植物全基因組DNA提取試劑盒（DP305）”（北京天根生物有限公司）提取，質量分數為1%瓊脂糖結合紫外分光光度計檢測DNA質量和濃度后稀釋至20 mg·L-1，4℃保存備用。

1.3 PCR擴增及數據統計分析

PCR擴增體系為20 μL，包括 10 μL 2×TaqMaster Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司），模板DNA（20 mg·L-1）5.0 μL， 正、 反向引物（2 μmol·L-1）各 1.5 μL， 雙蒸水（ddH2O）2.0 μL。 PCR 擴增程序為： 95℃預變性5 min；然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸8 min后4℃保存。取1.5 μL的PCR擴增產物，質量分數為8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒定功率100 W，100 min）分離檢測，使用pBR322 DNA/MspI Marker作為標準分子量，銀染拍照保存。

表1 供試16份花椒屬種質資源來源地Table 1 Origin of 16 germplasms of Zanthoxylum

根據電泳圖像，統計擴增條帶并構建0～1數據矩陣，即有共遷移條帶記為1，無條帶則記為0。利用NTSYSpc-2.10軟件計算遺傳相似系數，采用非加權配對算術平均法（UPGMA）進行遺傳相似性聚類。

2 結果與分析

2.1 花椒葉綠體基因組中SSR的分布特點

花椒葉綠體基因組全長為158401 bp，共搜索出了144個SSR位點（圖1和表2），即在花椒葉綠體基因組中平均每隔1100.00 bp出現1個SSR位點。

根據SSR位點在花椒葉綠體基因組中的位置（圖1）可知：LSC區分布85個SSR位點，占SSR總數的59.03%，平均1010.56 bp出現1個SSR位點；SSC區分布23個SSR位點，占SSR總數的15.97%，平均765.65 bp分布1個SSR位點；在 2個 IR區（IRA和IRB），均分布18個反向重復的SSR位點，合計占SSR總數的25.00%，平均1524.72 bp分布1個SSR位點。

圖1 SSR在花椒葉綠體基因組中的分布特點Figure 1 Distribution of SSRs in the chloroplast genome of Zanthoxylum bungeanum

數量上，單核苷酸重復和三核苷酸重復分別有62和70個，兩者占SSR總數的91.67%，且在LSC區、SSC區和IR區均有分布。二核苷酸重復和四核苷酸重復分別只有5個（3.47%）和7個（4.86%），但二核苷酸重復僅分布于SSC區，而四核苷酸重復僅分布于LSC區。

重復次數上，單核苷酸重復次數多集中在10～15次，共54個位點，占單核苷酸重復總數的87.10%，而重復數＞15次的共有8個位點；二核苷酸重復數集中在5次，三核苷酸和四核苷酸重復數集中在3次。根據重復基元類型，單核苷酸重復中A/T重復共60個，而C/G重復位點僅有2個；二核苷酸重復基元均為AT/TA；AAG/CTT和AAT/ATT為三核苷酸重復中的優勢重復基元，均為25個，其余重復基元總計為20個；此外，AAAT為四核苷酸重復中的優勢重復基元（3個），其余重復基元總計為4個（表2）。

2.2 多態性標記開發與通用性分析

根據SSR位點兩側序列，由Primer3軟件設計了30對引物（命名為YLT-01～YLT-30）并合成。其中，YLT-01～YLT-20擴增片段包含的是2個及2個以上的核苷酸重復位點（YLT-01～YLT-12位于LSC；YLT-14～YLT-18位于SSC區；YLT-13、19、20位于IR區），YLT-21～YLT-30擴增片段包含的是單核苷酸重復位點（YLT-21～YLT-27位于LSC區；YLT-30位于SSC區；YLT-28、29位于IR區）。

表2 花椒cpSSR的重復類型與次數Table 2 Repeat types and times of cpSSR in Zanthoxylum bungeanum

經PCR擴增篩選，30對引物均能擴增出穩定的目的片段。其中，10對引物在供試種質中呈現多態性，占篩選引物總數的33.33%。如表3所示：10對引物共檢測到24個等位基因。其中，YLT-26包含4個等位基因，YLT-21和YLT-29包含3個等位基因，其余的7個位點（YLT-01，YLT-17，YLT-22，YLT-23，YLT-24，YLT-25和YLT-27）均檢測出2個等位基因。在包含2個等位基因的7個位點中，YLT-01，YLT-17，YLT-24，YLT-25和YLT-27能區分出日本花椒，花椒與竹葉花椒為一類（擴增片段大小一致），而YLT-22和YLT-23的擴增結果為：10份花椒種質同一帶型，竹葉花椒與日本花椒為同一帶型；YLT-21和YLT-29能將花椒、竹葉花椒和日本花椒區分開；YLT-26不僅能區分出花椒、竹葉花椒和日本花椒3個花椒屬的不同種，且能區分出竹葉花椒種質中的狗椒。此外，未檢測到有標記在10份花椒種質呈現多態性（圖2）。

在設計的20對包含2個及2個以上的核苷酸重復位點的引物中，僅有2對引物表現出多態性；而包含單核苷酸重復位點的10對引物中，有8對引物呈現多態性，多態性比例遠高于包含多核苷酸重復的位點。

表3 多態性SSR引物的基本信息Table 3 Characterizations of polymorphic SSR primers pairs

2.3 聚類分析

基于10個多態性標記的檢測結果，利用NTSYSpc-2.10軟件對供試的16份花椒屬種質進行UPGMA聚類分析。如圖2所示：在遺傳相似系數閾值為0.22時，可將16份花椒種質聚為2類，即花椒和竹葉花椒為1類，日本花椒為1類；在遺傳相似系數閾值為0.59時，可將花椒和竹葉花椒分為2個小類；而在遺傳系數閾值為0.91時，可將竹葉花椒中的狗椒與其他4種竹葉花椒種質區分為2個小類。聚類結果與多態性標記的鑒定結果保持一致。

圖2 16份花椒屬種質的UPGMA聚類分析Figure 2 Cluster diagram for 16 germplasms of Zanthoxylum by UPGMA method

3 討論

本研究在花椒的葉綠體基因組中共篩選到144個SSR位點，其中三核苷酸重復的數量要高于單核苷酸重復以及二核苷酸和四核苷酸重復的數量，與楊麗等［14］在麻竹Dendrocalamus latiflorus和綠竹Bambusa oldhamii葉綠體基因組中獲得的SSR位點的規律一致，但與蒺藜苜蓿Medicao truncatula［15］，棉花Gossypium hirsutum［16］和霍山石斛Dendrobium huoshanense［17］等的葉綠體基因組中均以單核苷酸重復為主不同。原則上，堿基重復基元越多，越難形成SSR位點。本研究在三核苷酸重復次數的篩選上，選擇重復數大于或等于3次的位點，而大于3次的重復位點僅占三核苷酸重復總數的11.43%（8個）。因此，本研究的三核苷酸重復數量多于單核苷酸重復是由軟件參數設置不同引起。此外，花椒cpSSR在LSC和SSC區的分布密度要高于IR區。在花椒葉綠體基因組中，GC質量分數在LSC區，SSC區和IR區中分別為36.87%，33.51%和42.54%［12］。由于GC間有3個氫鍵相連，打破GC鍵所需的能量要高于AT間的2個氫鍵，因此更難造成堿基數量的增加或減少［18］。由此推斷，花椒葉綠體基因組中IR區SSR位點相對稀疏的原因與GC質量分數相關。

葉綠體基因組由于保守性高，不涉及基因重組，因此，其中突變位點也更容易保留，基于葉綠體開發的SSR標記除了保留核基因組SSR標記的特點外，其可重復性也更高，在種質資源鑒定中也更具說服力［19］。在本研究獲得的10個多態性引物中，有2對引物可以把本研究所選花椒屬的3個種區分開，1對引物可以將竹葉花椒種內的 ‘狗椒’區分出。然而，10對多態性引物均未在10份花椒種質資源中表現出多態性。由此推斷，相對于竹葉花椒，花椒種內的種質資源在葉綠體基因組進化上保守性更高。

本研究開發的花椒cpSSR可作為花椒屬種間鑒定的有效標記，但要應用于種內鑒定，需進一步篩選種間多態性更高的cpSSR標記或利用EST-SSR、核基因組SSR（Genomic-SSR）等保守性相對較低的標記資源進行區分。