藥用植物中GRAS轉錄因子的功能研究進展

劉云輝，李 珅，王 洋，羊 健，周 偉，沈亞芳

（1.浙江農林大學 農業與食品科學學院 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 杭州311300；2.浙江省農業科學院 農業部/浙江省植保生物技術重點實驗室，浙江 杭州 310021）

轉錄因子（transcription factors，TFs）又稱反式作用元件，能夠直接或間接與基因啟動子區域順式作用元件發生特異性結合，并調控基因的轉錄。GRAS蛋白是近年來發現在植物中特有的一類TFs，其命名由最初被發現的 3個成員 GAI（gibberellic acid insensitive），RGA（repressor of GA1-3 mutant）和 SCR（scarecrow）的特征字母而來。GRAS家族成員眾多，包含10個主要亞家族，廣泛參與植物生長發育、激素信號的轉導、光信號通路的轉導、根部輻射形態的形成、分生組織的維持以及逆境脅迫的響應等過程［1］。目前，在全基因組上挖掘GRAS TFs家族成員的研究工作已在多個物種，如菘藍Isatis indigotica，木麻黃Casuarina glauca，丹參Salvia miltiorrhiza，擬南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa等物種中展開。部分GRAS家族成員的功能主要在水稻和擬南芥等模式植物進行了系統研究，但在藥用植物中，GRAS候選轉錄因子的挖掘與功能解析的研究工作進展相對緩慢。本研究將對GRAS家族蛋白的結構特征、功能特性以及在藥用植物中的最新研究進展進行綜述，在總結前人研究成果的基礎上，結合自身的研究展開分析，以期為后續在藥用植物中開展對GRAS TFs家族成員的功能及應用研究提供思路和參考。

1 GRAS轉錄因子家族的蛋白結構特征

GRAS蛋白一般由400～770個氨基酸殘基組成，不同家族成員的氨基酸序列和長度一般存在較大的差異。典型的GRAS蛋白具有高度保守的羧基端（C-Terminal，C端）（圖1），其C端一般為組氨酸和天門冬氨酸組成的基序VHIID（valine，V，纈氨酸；histidine，H，組氨酸；isoleucine，I，異亮氨酸；D-aspartic acid，D,D-天冬氨酸）。在VHIID兩側是富含亮氨酸結構的LRⅠ（leucine-rich regionⅠ，LRⅠ）和LRⅡ（leucine-rich regionⅡ，LRⅡ），LRⅠ基序中包含1個核定位信號區域（nuclear localization signal，NLS），而在LRⅡ則是包含LXXLL結構（L：亮氨酸；XX：2個任意氨基酸殘基）。PFYRE基序（proline，P，脯氨酸；phenylalanine，F，苯丙氨酸；tyrosine，Y，酪氨酸；arginine，R，精氨酸；glutamic acid，E，谷氨酸）和RVER基序（arginine，R，精氨酸；valine，V，纈氨酸；glutamic acid，E，谷氨酸）靠近LRⅡ區域；而在最后的是SAW基序（ser，S，絲氨酸； ala，A，丙氨酸；trp，W，色氨酸）［2］。VHIID基序與兩側的LRⅠ和LRⅡ基序是GRAS家族蛋白的標志性結構域，幾乎存在于所有的GRAS家族成員中，該結構域在后續的實驗中被證明參與蛋白間和蛋白與核酸間的相互作用［3］。迄今為止，GRAS蛋白PFYRE和SAW基序的具體功能仍不清楚；但由于這2個結構較為保守，暗示它們對維持蛋白的空間結構和生物功能有重要的作用［4］。GRAS蛋白的氨基端（N-terminal，N端）是一個長度和氨基酸序列組成均可高度變化的伸展區域，暗示該區域與各個亞家族功能特異性密切相關［5］。

圖1 GRAS轉錄因子家族的蛋白結構示意圖Figure 1 Schematic diagram of GRAS transcription factor family protein

2 利用組學方法挖掘藥用植物GRAS轉錄因子家族成員

目前，僅有從菘藍，木麻黃，丹參，蓖麻Ricinus communis，百脈根Lotus japonicus和蓮Nelumbo nucifera等藥用植物中有分離與鑒定GRAS轉錄因子家族成員的研究報道（表1）。十字花科Cruciferae菘藍又名茶藍、板藍根，以干燥葉和根入藥稱 “板藍根”，葉入藥稱 “大青葉”，具有清熱解毒、涼血消斑的功效，可用于治療溫病發熱、發斑、風熱感冒、咽喉腫痛、丹毒、流行性乙型腦炎、肝炎和腮腺炎等癥。利用全基因組數據，從菘藍中分離了10個亞家族共41個GRAS基因成員；轉錄組測序表明：5個DELLA成員和5個PAT1成員都能響應甲基茉莉酸（MeJA）的誘導而顯著上調；而1個DELLA成員、1個PAT1成員、2個LAS家族成員以及2個SCL4/7成員都顯著下調。但41個成員的具體功能未知，有待于進一步研究［6］。木麻黃科Casuarinaceae木麻黃又稱木賊葉木麻黃、木賊麻黃，以幼嫩枝葉或樹皮入藥。藥性溫、藥味辛、苦。功效為宣肺止咳，行氣止痛，溫中止瀉，利濕?？捎糜谥委煾忻鞍l熱、咳嗽、疝氣、腹痛、泄瀉、痢疾、小便不利、腳氣腫毒。目前從木麻黃的EST序列中鑒定了2個亞家族共11個GRAS基因成員，但各自功能未知［7］。從唇形科Labiatae丹參基因組中克隆了SHR，PAT1，SCL4/7和SCL3共4個亞家族5個GRAS成員，均在莖和葉片中的表達量較高。5個成員都響應GA誘導而顯著上調，而SHR家族成員GRAS1，PAT1家族成員 GRAS4，SCL4/7和GRAS5還響應乙烯的誘導而顯著上調［8］。大戟科Euphorbiaceae蓖麻以根及葉入藥。夏秋采根及葉，分別曬干或鮮用。葉能消腫拔毒、止癢、治瘡瘍腫毒、治濕疹搔癢。根能祛風活血、止痛鎮靜，用于風濕關節痛、破傷風、癲癇、精神分裂癥。目前從從蓖麻基因組中分離9個亞家族共46個GRAS基因成員。然而，不同組織部位的轉錄組測序共檢測到31個GRAS家族成員表達；其中17個GRAS家族成員在葉片中的表達最高，8個GRAS家族成員在根中的表達量最高，6個GRAS成員在種子的胚乳中的表達量較高。此外，還對其中36個GRAS成員在干旱、高鹽、冷害和熱脅迫處理下的表達特征進行了檢測分析，發現其至少能響應其中1種非生物脅迫，表達量顯著上調，暗示此36個GRAS家族成員在蓖麻中能夠有效的抵抗非生物逆境的脅迫，具有重要的生物學意義［9］。豆科Laguminosae植物百脈根以根入藥，味甘苦、微寒、無毒。功能主治下氣、止渴、去熱、除虛勞、補不足。目前，從百脈根基因組中鑒定了6個亞家族共18個GRAS基因成員。研究證實：2個GRAS蛋白家族成員RAD1能與RAM1蛋白互作，促進豆科植物百脈根叢生菌根的生長發育［10］。睡蓮科Nymphaea tetragona植物蓮以花蕾入藥，味苦、甘、性平、歸心、肝經；具有散瘀止血、祛濕消風的功效。常用于損傷嘔血、血淋、崩漏下血、天泡濕瘡、疥瘡瘙癢；目前在其基因組中分離了9個亞家族共38個GRAS基因成員，但各成員的功能未知［11］。

表1 藥用植物GRAS轉錄因子的分離與亞家族分類Table 1 Isolation and subfamily classification of GRAS transcription factors in medicinal plants

3 GRAS轉錄因子家族成員的生物學功能

依據結構特征及功能特點GRAS家族成員可劃分為DELLA，HAM，LISCL，PAT1，LAS，SCR，SCL4/7，DLT，SHR和SCL3等10個主要亞家族［1］。目前在藥用植物中圍繞10個亞家族成員功能的具體研究報道甚少。在擬南芥、水稻等模式植物中對GRAS亞家族成員功能的最新研究能為藥用植物的同類研究提供很好的參考（表2）。

3.1 SCR和SHR亞家族主要調控植物根輻射形態的形成與發育

植物根的生長發育主要由細胞分裂和分化來共同調節，而根的形成是由干細胞通過一系列不對稱分裂產生根的內外皮層，再通過差異分化形成了形態各異的組織。SCR（scarecrow）和SHR（short-root）是GRAS TFs家族中2個亞家族，兩者均作為正向調控因子調節擬南芥根輻射形態的生長，并對根單層細胞的形成起重要的調節作用［12-13］。對擬南芥的研究發現：SCR主要在根表皮細胞中表達，當SCR功能缺失突變時會影響細胞層的正常發育。SCR僅調控基本組織子細胞的分裂過程，而SHR不僅能影響根內皮層細胞的極性分化，還能在特定組織中激活SCR啟動子，使SHR通過介導SCR來發揮調控子細胞分化的能力［14］。此外，SHR蛋白具有移動的特性；盡管其在中柱鞘細胞中特異表達，但卻能夠從外部的單層細胞轉移至內皮層細胞中與SCR相互結合形成二聚體，共同激活SCR基因和相關下游靶基因的轉錄。SHR蛋白的VHIID基序和PFYRE基序的N末端序列能夠穩定蛋白結構，使SHR跨膜運動能夠順利完成。SCR和SHR均能促進SIEL（short-root interacting embryonic lethal）的表達，而SIEL能夠促進SHR移出中柱鞘細胞完成跨膜運動［15］。綜上所述，SCR和SHR在轉錄關系上具有相互依賴性，所形成的SCR-SHR復合體能正向調節SCR。SCR和SHR除了在植物根部發育的過程中起重要作用外，還對植物葉和芽的發育起重要的調節作用。因此，此GRAS亞類轉錄因子的深入研究對以根和葉入藥的藥用植物具有重要意義。

表2 GRAS轉錄因子亞家族的分類與功能描述概要Table 2 Subfamily classification and brief description of GRAS transcription factors

3.2 LISCL亞家族主要調控植物細胞的伸長與分裂

對麝香百合Lilium longiflorum的研究表明：LISCL（Lilium longiflorum Scarecrow-Like）亞家族在植物轉錄調控中發揮著重要的作用。LlSCL蛋白N端具有轉錄激活活性，在減數分裂前期能與控制花藥細胞減數分裂相關基因的啟動子相結合，起轉錄激活的作用，促進細胞的分裂［16］。輻射松Pinus radiata的PrSCL1基因和歐洲板栗Castanea sativa的CsSCL1基因均在根部高通量表達，能夠響應外源生長素的誘導，影響早期不定根細胞的伸長與發育［17］。煙草Nicotiana tabacum的LISCL亞家族成員NtGRAS1基因在根部表達量最高，促進根細胞的伸長［18］。由此可見，LISCL亞家族成員的功能主要是調控植物細胞的生長與分裂。

3.3 DELLA亞家族在赤霉素、茉莉酸和光信號介導下調控植物的生長發育

赤霉素（gibberellin，GA）為四環二萜類化合物，起調控植物生理的作用，如種子萌發、下胚軸伸長、植物的營養生長等。在GRAS TFs家族中，DELLA蛋白是研究最為深入的一類。最早在擬南芥中共發現了5個DELLA蛋白成員，隨后在其他物種中也發現了DELLA的家族成員。DELLA蛋白的主要特征是在N末端含有DELLA保守結構域，該結構域對赤霉素信號的感知是必不可少的。DELLA蛋白作為GA信號通路中的關鍵調控元件，起負調控的作用，阻遏植物的生長發育。在信號轉導途徑中，GA能與赤霉素受體蛋白GID1（gibberellin insensitive dwarf 1）相結合形成GA/GID1復合體，并與DELLA蛋白N端的DELLA結構域相結合形成新的GA/GID1/DELLA三元復合體；隨之26 S蛋白酶將DELLA蛋白泛素化并降解，從而解除DELLA蛋白對植物生長的抑制作用。研究還發現：DELLA蛋白能夠與光敏色素互作因子PIFs（phytochrome interacting factors，PIFs）相互作用，通過阻遏PIFs對相應下游靶基因的轉錄激活，進而抑制光信號介導的植物生長發育［19］。

此外，茉莉酸（jasmonic acid，JA）作為一類重要的植物激素，不僅能夠調控植物對病蟲害的免疫防衛，同時對生長發育也產生重要的影響。植物TFs MYC2（myelocytomatosis 2）和茉莉酸阻遏蛋白JAZs（jasmonate ZIM-domain）處于茉莉酸信號通路的核心位置。研究發現：擬南芥DELLA蛋白能夠與茉莉酸阻遏蛋白JAZ1（jasmonate ZIM-domain 1）相互作用，阻礙JAZ1對MYC2的抑制，進而釋放出MYC2，促進MYC2與下游靶基因的結合，從而增強JA信號介導的MYC2的調控作用［20］。研究還發現：DELLA是一個功能多樣的調控基因，對植物的干旱、冷害、一氧化氮（NO）等逆境脅迫以及植物的生長發育都能起到重要的調控作用［21］。利用比較轉錄組測序，LIU等［22］從蘭科Orchidaceae藥用植物金線蓮Anoectochilus roxburghii中挖掘了11個編碼DELLA蛋白的單基因簇，推測其受蘭科共生菌誘導，能促進種子的萌發。在藥用植物丹參中的研究發現，MYC2能夠促進藥用活性物質丹酚酸的代謝合成［23］。DELLA蛋白能否與JA信號通路中的JAZs和MYC2蛋白互作調控藥用植物活性物質的代謝合成或是生長發育，尚無明確的報道。

3.4 SCL3亞家族在赤霉素信號介導下調控植物根系的發育

SCL3（scarecrow-like 3）是GRAS TFs家族的另一重要亞家族成員。在擬南芥中研究發現：SCL3主要在根的內皮層中表達，對根的伸長起重要的調控作用；同時也參與植物地上和地下部分的器官發育。SCL3通過與DELLA蛋白互作來影響下游的GA信號通路，其作為正調控因子調節植物體內的GA平衡，從而影響生長發育［24］。SCL3不僅在GA/DELLA的調控途徑中發揮重要作用，同時聯合SHR/SCR轉錄因子共同調控根部細胞的伸長與分裂［25］。由此可見，SCL3亞家族成員的功能主要是在GA信號介導下調控植物根系的發育。對以根入藥的藥用植物而言，在收獲前期用GA3進行誘導處理，有望提高產量，具有重要的研究價值。

3.5 SCL4/7，LAS和HAM亞家族主要調控頂端分生組織的分化

GRAS家族中LAS亞家族成員在腋芽生長發育過程中起重要的調節作用。擬南芥AtLAS是控制葉腋分生組織發育的關鍵基因，其功能缺陷突變體由于在營養生長階段失去分生能力導致不能形成側枝［26］。目前已在番茄Solanum lycopersicum，水稻，黃瓜Cucumis sativus和結縷草Zoysia japonica等物種中發現具有相似功能的LAS基因［27］。OsMOC1是AtLAS在水稻中的同源基因，僅在腋芽中表達；過表達后增加分蘗數量；而OsMOC1缺失突變體則表現不分蘗，同時2個調控水稻分蘗的基因OsSH1和OsTB1也不表達［27-28］。

HAM（hairy meristem）是GRAS轉錄因子的亞家族之一，在矮牽牛Petunia hybrida中發現的PhHAM是最早被證明能夠維持莖尖分生組織分化的相關基因；其通過維持頂端分生組織干細胞處于未分化的狀態，使頂端分生組織具有不斷分化的能力［12］。在擬南芥中，AtLAS也具有保持分生組織具有長久分化能力的功能；且PhHAM和AtLAS兩者擁有相同的下游靶點，可通過相似的途徑共同控制植物分生組織的生長發育［12,27］。甘藍型油菜Brassica napus中BnSCL1（SCR-Like 1，SCL1）也是HAM亞家族的一員；Bn-SCL1受生長素的調控來影響植物根的生長發育［12,29］。這說明HAM亞家族成員的功能調控模式在不同物種中存在一定的差異。

近期，在陸地棉Gossypium hirsutum基因中也鑒定了4個SCL4/7亞家族成員，但功能未知［30］。FAMBRINI等［31］研究發現：向日葵Helianthus annuus HaGRASL基因隸屬于GRAS SCL4/7亞家族。在擬南芥中超表達HaGRASL能降低植株體內GAs的含量，從而調控腋分生組織的起始分化。目前，已從菘藍、木麻黃、丹參、蓖麻、百脈根、蓮等6種藥用植物中鑒定了GRAS SCL4/7亞家族的新成員，但關于其具體功能尚未見報道［6-11］。

3.6 PAT1亞家族調控光敏色素信號通路的轉導和病害免疫應答

光是重要的環境信號，對植物生長發育具有重要調節作用。不同的光波長、強度和光周期都會對植物生長產生影響［32］。在進化過程中，植物通過產生光敏色素來分辨不同的光信號，從而達到適應環境的目的。植物光敏色素主要分為A，B，C，D和E五大類。在GRAS轉錄因子家族中，擬南芥PAT1（phyto-chrome A signal transduction 1）和SCL21（SCR-Like 21）基因均參與光敏色素 A 的信號轉導［33］；由于AtPAT1缺少核定位信號結構，致使其定位于細胞質中，因此推測光敏色素A早期信號轉導發生在細胞質中［34］。研究表明：AtPAT1和AtSCL21蛋白能相互作用，參與光信號的轉導過程，但兩者組織表達特征存在著明顯的差異；PAT1亞家族成員AtSCL21在成熟種子中高通量表達，而AtPAT1在不同組織部位的表達量則較為均一；經遠紅光、紅光、藍光和白光處理后，SCL21表達量會下降，而PAT1則無明顯變化，說明兩者在光信號轉導調控途徑中的作用模式存在著較大差異［35］。AtSCL13歸屬于PAT1亞家族，不僅參與調控光敏色素A信號通路，同時也作為正調控因子參與紅光下光敏色素B信號的轉導［36］。研究表明：AtSCL13在細胞質和細胞核中都有表達，過表達AtSCL13能提高細胞對紅光的敏感度。綜合對比PAT1，SCL21以及SCL13的蛋白結構發現，SCL13在N端缺少一個EAISRRDL基序，影響基因在光敏色素信號通路中的功能。PAT1家族成員的完整時空調控模式還有待于更進一步深入的研究。此外研究還發現：水稻PAT1亞家族成員CIGR1（chitin-inducible gibberellin-respensive 1）和CIGR2（chitin-inducible gibberellin-respensive 2）基因的表達還受到DELLA蛋白的調控，參與GA信號介導的免疫應答反應，提高水稻的抗病能力［37］。

3.7 BR信號介導DLT亞家族成員調控植物株型和谷粒的形態

油菜素內酯類似物（brassinosteroids,BRs）被公認為第六大植物激素，其作用主要為調控植物細胞的伸長與分裂、葉片的形態、衰老等［38］。DLT（Dwarf and low-tillering）亞家族是水稻研究中發現的最新GRAS家族成員。XIAO等［39］研究發現：水稻GSK2蛋白激酶能夠與DLT基因的啟動子結合，調控DLT基因的表達，從而調控BRs的信號轉導。研究還發現：在水稻中超表達OFP1（ovate family protein 1）能夠擬制赤霉素（GA3）的合成，促使水稻植株體內產生高濃度的BRs，從而擬制水稻的生長。同時產生的BRs信號能夠促進OFP1（ovate family protein 1）與DLT蛋白互作，調控水稻的株型和谷粒的形態。

4 總結與展望

GRAS轉錄因子在植物生長、發育、環境脅迫響應、生長信號轉導等方面發揮著重要的調控作用。目前圍繞GRAS家族成員的功能研究主要從以下幾方面展開：①GRAS TFs在GA,MeJA和BR信號通路中的調控作用特征；②GRAS TFs在光信號介導下的調控作用；③GRAS TFs對植物根系和葉片發育的調控作用特征；④GRAS TFs對植物株型和谷粒的形態調控作用；⑤GRAS TFs對腋生分生組織形成和維持的調控作用；⑥GRAS TFs響應病害等環境脅迫的分子調控機制。對整個GRAS家族而言，目前功能已知的家族成員所占比例較小，而且相關研究主要集中在模式植物擬南芥和水稻中。GRAS TFs在藥用植物中的挖掘與應用研究報道甚少。近期，BAI等［8］研究發現：GRAS基因受到外源GA和Eth（Ethylene）的正調控促進丹參酮的積累，暗示GRAS TFs可通過GA或Eth信號介導參與丹參次級代謝物的生物合成。由此可見，GRAS TFs家族可能在藥用活性物質的代謝合成過程中具有重要的調節作用。

隨著 “中醫藥現代化建設”國家戰略的提出，利用現代生物技術手段提高中藥材的品質，從藥源確保中藥材的品質是當今理論和應用研究的熱點。因此，可從以下方面開展藥用植物研究：①GRAS TFs依據保守結構域特征可劃分成為10個主要的亞家族，每個家族成員的功能差別較大，目前每個亞家族保守結構域的完整分子作用特征還有待進一步深入的解析。②GRAS蛋白N端的可變序列也是功能分化的重要基序，對其功能進行系統的研究，具有重要的理論指導意義。③盡管目前通過常規的分子生物學和遺傳學研究手段已鑒定一些GRAS家族成員，但每個成員的完整分子機制并不清晰?？梢酝ㄟ^現代組學測序技術，結合關聯分析，挖掘與GRAS家族成員互作的候選蛋白，并結合分子和生物化學分析技術解析和闡明其完整的調控網絡。④GRAS TFs有些定位于細胞核，有些定位在細胞質中與其他TFs相結合形成 TFs復合體而行使功能；同一GRAS TFs也可以與不同的蛋白成員相結合，在不同的信號途徑（譬如GA信號、BRs信號、MeJA信號等）中發揮著完全不同的功能。因此，深入研究GRAS特定家族成員的類似功能，將在藥用植物逆境脅迫和品質改良方面具有重要的應用前景。 ⑤目前在藥用植物開展表觀遺傳調控是一個研究熱點。因此可利用第3代轉錄組測序、甲基化測序等現代技術手段深入研究小RNA（MicroRNA），長鏈非編碼RNA（lncRNA）和甲基化（Methylation）等表觀修飾調控與GRAS TFs的協同調控作用模型。