祛瘀生新膠囊藥效學及急性毒性實驗研究*

穆慶麗，喬 園，郭 冬

（陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003）

祛瘀生新膠囊為治療缺血性股骨頭壞死的經驗方，具有通絡止痛、消腫散結、溫通經脈等功效，臨床應用多年，療效確切，不良反應較少。其由黃芪、桂枝、三棱、莪術、土貝母、制馬錢子等水煎、提取（2次）、濃縮至所需質量濃度（1 mL藥液中含1 g生藥）而成。本研究中考察了其藥效作用與急性毒性情況。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：KM 小鼠 184 只，體質量（20±2）g，雌雄各半，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（陜）2007-001。小鼠飼養于恒溫（22～25℃）、恒濕、屏障環境中，自由飲水。

儀器：BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平廠）；721型分光光度計（上海第三分析儀器廠）；ZH-ZZY型足趾容積測量儀（淮北正華生物儀器設備有限公司）

試藥：祛瘀生新膠囊（陜西省中醫藥研究院研制，批號為20110801）；吲哚美辛片（臨汾奇林藥業有限公司，國藥準字H14020549，批號為20110702，規格為每片25 mg）；阿司匹林腸溶片（陜西白鹿制藥股份有限公司，國藥準字 H61023177，批號為 111201，規格為每片25mg）；角叉菜膠（遼寧省藥物研究所，批號為20110822）；冰醋酸為分析純，水為去離子水。

1.2 方法[1-3]

急性毒性預試驗：取KM小鼠24只，分為6組（每組4只，雌、雄各半）進行2次實驗，得到動物0死亡劑量（Dn）為 25.648g／kg，100% 死亡劑量（Dm）為 57.803g／kg，分別作為上下限。以預實驗獲得的Dm作為正式實驗中的高劑量，求得比值為0.85，等比求得其他各劑量。

急性毒性試驗：取KM小鼠60只，均編號標記并稱定質量，隨機分為6組（記為A～F組），每組10只，雌雄各半，劑量分別為 57.803，49.133，41.763，35.499，30.174，25.648 g ／kg，給藥前禁食不禁飲 12 h。24 h 內灌胃3次，給藥間隔時間4 h，給藥體積每10 g體質量0.4 mL。用藥后連續觀察30 min，最初6 h內每1 h觀察1次，之后每天觀察2次，持續2周，觀察小鼠的一般活動情況及存活情況（見表1），并記錄小鼠行為活動、狀態、飲食、大小便及毛色、分泌物和死亡數目、死亡時間及主要毒性反應。對觀察期內死亡小鼠進行解剖學檢查，并記錄病理變化。

表1 急性毒性實驗觀察內容

小鼠半數致死量測定：按Bliss′s法[4-5]統計各組死亡數，計算死亡率及半數致死量（LD50）、95%置信區間（CI）。

角叉菜膠致小鼠足趾腫脹試驗[6-8]：取KM小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。模型組小鼠灌胃去離子水20 mL／kg，陽性對照組小鼠自實驗第3天開始灌胃阿司匹林0.2 g／kg，共3次；祛瘀生新膠囊高、中、低劑量組小鼠分別灌胃 1.2，0.6，0.3 g ／kg（分別為人用量的 30，15，7.5 倍）；每天 1 次，連續 4 d。第 5 天給予角叉菜膠前先測所有小鼠左后足跖圍（用手術線在左后足跖同一部位纏繞2周，剪下，量手術線的長度作為足跖圍）。末次給藥的同時，所有小鼠左后足皮下注射1%角叉菜膠0.05 mL，然后每隔1 h測左后足跖圍1次，共測4次，作為腫脹值，腫脹值減去致炎前足跖圍即為腫脹度。

冰醋酸致小鼠疼痛試驗[2，9]：取KM小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。模型組小鼠灌胃去離子水20 mL／kg，陽性對照組小鼠在實驗第5天灌胃吲哚美辛腸溶片1次（15 mg／kg），祛瘀生新膠囊高、中、低劑量組小鼠分別灌胃 1.2，0.6，0.3 g ／kg；連續 5 d，末次給藥后30 min，腹腔注射 0.8%冰醋酸0.2 mL，5 min后，統計小鼠在10 min內的扭體次數（腹部收縮內凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行），計算扭體反應抑制率[抑制率（%）=（模型組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數）／模型組平均扭體次數×100%]。

1.3 統計學處理

采用SPSS21.0統計學軟件分析。計量資料以表示，組間數據行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般生長狀況

給藥后，部分小鼠初始自發活動減少、倦臥不動、嗜睡、瞇眼，繼而動物出現震顫、抽搐、麻痹、運動失調、躥動、全身肌肉強直性痙攣，直至死亡（死亡癥狀為角弓反張）。第1次給藥后20 min，A組小鼠開始死亡，死亡時間多集中在第1次和第2次給藥后1 h，B組小鼠的死亡時間多集中在第2次和第3次給藥后1 h，C組和D組小鼠的死亡時間多集中在第3次給藥后1 h到次日早晨。在 57.803 g／kg，49.133 g／kg 劑量下，存活小鼠大多數開始出現自發活動減少、倦臥不動、嗜睡、瞇眼，繼而出現震顫、抽搐、麻痹、運動失調、躥動、全身肌肉強直性痙攣等臨床表現，對死亡小鼠進行解剖，肉眼可見其胃充盈，腸管脹氣，余未見異常。最終存活小鼠給藥14 d后逐只處死、解剖，并肉眼觀察，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃、腸等重要臟器、器官及胸腔、腹腔未見顏色、形態異常，無出血點或其他病理改變，胃黏膜顏色紅潤，無出血點或潰瘍，尸檢無異常。

2.2 半數致死量

灌胃給予 57.803，49.133，41.763，35.499，30.174，25.648 g／kg祛瘀生新膠囊后，各組小鼠死亡數分別為10，9，7，3，1，0 只。回歸方程式：P（Probit）=-16.42368+13.512 22 × log（D），r=0.994 185，LD50=38.503 8 ±3.124，95%CI（35.651 3，41.584 6）。

2.3 對小鼠足趾腫脹的影響

結果見表2。

表2 祛瘀生新膠囊對角叉菜膠所致小鼠足趾腫脹度的影響（X ± s，n=10）

2.4 對小鼠疼痛的影響

結果見表3。

表3 祛瘀生新膠囊對小鼠扭體反應的影響（n=10）

3 討論

祛瘀生新膠囊根據臨床經驗方加工制成，臨床主要用于治療風、寒、濕、邪等多種原因引起的髖部疼痛、腫脹、屈伸活動受限、行走困難功能障礙性疾病[10]。方中制馬錢子的主要成分為士的寧，可通絡止痛、消腫散結[11]；桂枝發汗解肌、溫通經脈，可促發汗、解熱、鎮痛、抗炎、抗過敏[12]；三棱行氣破血，消積止痛[13]；黃芪補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌[14-15]。全方共奏通絡止痛、消腫散結、溫通經脈之功效。

毒理學研究是藥物研究的中心環節，是評價藥物安全的重要指標，本試驗中通過小鼠灌胃最大給藥量的急性毒性實驗觀察祛瘀生新膠囊的用藥安全性。結果該藥的Dn和Dm分別為 25.648 g／kg和 57.803 g／kg。角叉菜膠致小鼠足腫脹法和冰醋酸致疼痛法是常用于評價或篩選抗炎作用藥物的經典模型，其作用機制主要是通過注射角叉菜膠使局部毛細血管擴張、血管通透性增高、滲出、水腫產生炎癥。1.2g／kg（2 ～3h），0.6g／kg（2 ～3h），0.3 g／kg（2 h）劑量的祛瘀生新膠囊可明顯降低模型小鼠足跖的腫脹度，給藥 1.2 g／kg和 0.6 g／kg 可明顯減少模型小鼠扭體次數，說明該藥有明顯的抗炎鎮痛作用，但對其深入的藥效學研究，長期毒性實驗及其抗炎鎮痛機制有待進一步研究。