抑制USP22基因對人結直腸癌細胞增殖的影響

王靜，趙成誠，榮婉

（1.武漢生物工程學院 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430415；2.武漢華聯科生物技術有限公司，湖北 武漢 430212）

結腸直腸癌（colorectal cancer, CRC）是全世界常見的胃腸腫瘤類型之一。據估計，2016年有134 490 例新發CRC 病例和49 190 例CRC 相關死亡病例[1]。手術切除、放化療仍然是目前CRC 治療的主要方式，化療藥物能夠顯著抑制CRC 進展[2-3]。但化療藥物的反復使用，易使腫瘤細胞產生耐藥性，致使化療方案最終失敗。為此，研究CRC 的發病機制及新的治療靶點，對開發新型的CRC 化療藥物，提高CRC 患者的生存率有重要的理論意義。

既往研究發現并確認與腫瘤轉移和治療預后相關的11 個癌癥死亡標簽[4-5]，泛素特異性肽酶22（ubiquitin-specifc protease 22, USP22）是其中之一。作為轉錄調控組蛋白乙?；瘡秃衔颯AGA 的組成部分，USP22 通過調控組蛋白的去泛素化來調節基因轉錄，發揮廣泛的生物功能，包括細胞周期進程、胚胎發育及端粒穩態[6-7]。USP22 在人正常組織中廣泛表達，但在惡性腫瘤如結直腸癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌及肺癌中表達量上升，與腫瘤發生、轉移有關[8-10]，這些研究表明USP22 在腫瘤發生及發展中具有重要作用。然而，USP22 對結直腸癌具體調控機制不詳。本研究采用特異性小干擾RNA（small interference RNA, siRNA）沉默結直腸癌細胞中USP22基因的表達，觀察結直腸癌細胞的增殖、周期及凋亡的變化，同時檢測相關蛋白的表達情況，以期初步闡明USP22 對結直腸癌細胞的生物學影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及試劑 HCT-116、SW480、HT-29 購自中國科學院細胞庫，結直腸癌組織芯片購自于武漢愛威爾生物科技有限公司，MTT、Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自于北京碧云天生物技術研究所，胎牛血清（FBS）、IMDM、L15、DMEM 培養基購自美國Gibco 公司，硝酸纖維素膜、發光液購自武漢華聯科生物技術有限公司，抗Cyclin B1 抗體、抗p21 抗體、抗CDK2 抗體、抗USP22 抗體、抗GAPDH 抗體、抗p53 抗體購自英國Abcam 公司，辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG 購自武漢博士德生物有限公司，其他常用生化試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器 二氧化碳CO2培養箱購自美國Thermo 公司，流式細胞儀購自美國BD 公司，電泳儀、電轉移購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光檢測USP22 表達 組織芯片脫蠟后，高壓抗原修復20 min；3% H2O2室溫溫育10 min，PBS漂洗，滴加USP22 抗體（1：20），4℃過夜；PBS 沖洗，Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔IgG（1：200），37℃孵育1 h，PBS 沖洗，滴一滴抗熒光淬滅封片液（含DAPI），約20 μl；蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 細胞培養及傳代 HCT-116、SW480、HC-29分別利用McCOY's 5A、L15、McCOY's 5A 培養基（含10% FBS、100 u/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素）37℃、5% CO2培養。細胞黏合度達到90%以上時，棄去培養液，PBS 沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，加培養液吹打均勻成單細胞懸液，按1：2 的比例傳代培養。

1.2.3 Western blotting 檢測結直腸癌細胞中USP22 表達 棄去培養基，用預冷PBS 洗2 次，加入RIPA 冰上 裂解20 min，收集細胞于離心管中，4℃ 12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。將25 μg 提取的蛋白行SDS-PAGE 電泳，半干式電轉至硝酸纖維素膜后，室溫封閉1 h，兔抗USP22 抗體（1：1 000）4℃孵育過夜，加羊抗兔二抗（1：10 000）37℃孵育1 h。TBST 洗滌3 次。采用ECL 發光顯影。并用Quantity One 軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.2.4 Western blotting 檢 測USP22 siRNA 干擾效率針對USP22（XM_005256575.2）設計特異性的靶序列（USP22 siRNA）5'-GCAGCTCACTATGAAGA AACT-3'；同時設置陰性對照序列（NC）5'-TTCTCC GAACGTGTCACGT-3'。將細胞分為對照組（未轉染組），NC 組（轉染NC 片段）和USP22 siRNA 組（轉染USP22 siRNA 片段），利用Lipofectamine 2000 轉染試劑盒轉染SW480 結直腸癌細胞；24 h 后，收集細胞，RIPA 提取蛋白，通過Western blotting 檢測USP22 表達情況。

1.2.5 細胞活力檢測 將SW480 細胞分為3 組，分組方式同1.2.4，分別進行轉染后，傳于96 孔板，37℃、5% CO2分別培養12、24、48、72 及96 h，每組設置5 個復孔。利用MTT 檢測試劑盒檢測每孔光密度（OD）值。

1.2.6 細胞周期檢測 將SW480 細胞分為3 組，分組方式同1.2.4，分別進行轉染24 h 后收集細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，吸取上清液。PBS 重懸漂洗細胞，緩慢加入700 μl 預冷的乙醇，使乙醇終濃度為70%，4℃固定過夜，1 000 r/min 離心5 min，預冷PBS 漂洗2 次。加入100 μl RNaseA（50 μg/ml），37℃水浴30 min，加入400 μl PI（50 μg/ml），4℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.7 細胞凋亡檢測 將SW480 細胞分為3 組，分組方式同1.2.4，分別轉染24 h 后收集細胞，加入Annexin V-FITC 及PI 染色，隨即進行流式細胞儀檢測分析。

1.2.8 Western blotting檢測 將SW480細胞分為3組，分組方式同1.2.4，分別轉染24 h 后棄上清液，收集細胞，RIPA 裂解收集蛋白，以Cyclin B1（1：1 000）、p21（1：800）、CDK2（1：1 000）、p53（1：1 000）為一抗，通過Western blotting 檢測各指標的表達。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織USP22 高表達

免疫熒光檢測發現，在結直腸癌組織中，USP22異常高表達；配對的癌旁組織中，USP22 呈陰性。見圖1。

2.2 結直腸癌細胞株USP22 表達情況

圖1 結直腸癌組織和癌旁組織中USP22 表達 （×200）

Western blotting 檢測發現，人結直腸癌細胞株HT-29、SW480、HCT-116 均表達USP22，HT-29、HCT-116和SW480 細胞中USP22 相對表達量（相對GAPDH）分別為（0.61±0.03）、（0.73±0.04）和（0.85±0.06）。各組細胞USP22 表達有差異（F=69.130，P=0.000）；與HT-29 細胞、HCT-116 細胞比較，SW480 細胞中USP22 表達量最高（P＜0.05），因此選擇SW480 細胞作為后續研究。見圖2。

2.3 USP22 siRNA 降低USP22 的表達

USP22 siRNA 轉染SW480 細胞，作用24h 后檢測USP22 的表達量。對照組、NC 組及USP22 siRNA 組USP22 相對表達量（相對GAPDH）分別為（0.98± 0.15）、（0.94±0.22）和（0.30±0.02），差異有統計學意義（F=200.600，P=0.000）。USP22 siRNA 組與對照 組比較，USP22 siRNA 可降低USP22 的表達量（P＜0.05）。見圖3。

2.4 USP22 抑制后細胞增殖能力情況

對照組、NC 組、USP22 siRNA 組在12、24、48、72 及96h 的OD 值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的OD 值有差異（F=315.312，P=0.000）；②3 組在相同時間段的OD 值有差異（F=716.226，P=0.000）；③3 組OD 值變化趨勢有差異（F=37.270，P=0.000）。見表1。

圖2 3 種細胞株中USP22 蛋白表達情況

2.5 USP22 抑制后細胞周期的變化情況

流式細胞術檢測結果顯示：對照組、NC 組及USP22 siRNA 組G0/G1期細胞占比分別為（43.16± 0.64）%、（45.35±0.85）%和（67.94±2.03）%，差異有統計學意義（F=322.800，P=0.000），USP22 干擾后，G0/G1期細胞占比較對照組升高（P＜0.05）；對照組、NC 組及USP22 siRNA 組S 期細胞占比分別為（38.54±1.05）%、（37.23±1.90）%和（16.36±0.75）%，差異有統計學意義（F=2628.000，P=0.000），USP22干擾后，S 期細胞占比較對照組降低（P＜0.05）。見圖4。

圖3 3 組USP22 的表達情況

2.6 USP22 抑制后細胞凋亡率的變化情況

細胞凋亡結果顯示，對照組、NC 組和USP22 siRNA 組早期凋亡細胞率分別為（6.59±0.11）%、（8.73± 0.14）%和（21.18±0.25）%，3 組凋亡率比較差異有統計學意義（F=492.800，P=0.000）。與對照組比較，USP22 siRNA 增加細胞早期凋亡率（P＜0.05）。見圖5。

表1 各組細胞在不同時間條件下OD 值的變化 （±s）

表1 各組細胞在不同時間條件下OD 值的變化 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與12 h 比較，P ＜0.05。

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h對照組 0.41±0.02 0.67±0.01② 0.79±0.06② 0.95±0.04② 1.24±0.05②NC 組 0.41±0.01 0.63±0.03② 0.74±0.06② 0.84±0.02② 1.07±0.07②USP22 siRNA 組 0.41±0.02 0.43±0.01①② 0.48±0.03①② 0.56±0.06①② 0.65±0.04①②

圖4 USP22 抑制后SW480 細胞周期的變化情況

2.7 USP22 抑制后周期相關蛋白的表達情況

對照組、NC 組和USP22 siRNA 組中周期蛋白 CyclinB1、CDK2 的表達有差異（F=377.346 和211.132，P=0.000），USP22 siRNA 組中CyclinB1、CDK2 的表達量較對照組降低（P＜0.05）；3 組p21 和p53 的表達量有差異（F=168.414 和392.018，均P=0.000），USP22 siRNA 組中p21、p53 的表達量較對照組升高（P＜0.05）。見表2和圖6。

圖5 USP22 抑制后SW480 細胞凋亡率的變化情況

表2 3 組周期相關蛋白相對表達量比較 （±s）

表2 3 組周期相關蛋白相對表達量比較 （±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05。

組別 CyclinB1 CDK2 p21 p53對照組 0.77±0.08 0.86±0.02 0.25±0.01 0.45±0.02 NC 組 0.75±0.08 0.84±0.04 0.26±0.02 0.48±0.03 USP22 siRNA 組 0.30±0.03? 0.43±0.09? 0.62±0.07? 0.91±0.09?F 值 377.346 211.132 168.414 392.018 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 USP22 抑制后，周期蛋白表達

3 討論

2005年，GLINSKY 等[11]對各種腫瘤組織的mRNA 水平進行分析，發現腫瘤組織中的11 個過表達的基因可以用作癌癥死亡標志基因，包括USP22、BUB1、HEC1/KNTC2、CCNB1、Ki67、Gbx2、FGFR2、ANK3、CES、BMI-1和RNF2。USP22 過表達可能與腫瘤發生、轉移、復發和耐藥性相關。有研究認為，利用慢病毒載體sh-USP22 能有效抑制USP22基因的表達，并有效抑制鼻咽癌CNE-2 細胞的裸鼠成瘤能力[12]。張琳等[13]研究認為，結直腸癌組織中USP22 的異常高表達可能參與結直腸癌的發生、發展過程。USP22 表達與胰腺癌細胞系對吉西他濱敏感性相關，抑制USP22 表達增加胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性，可有效逆轉吉西他濱的耐藥[14]。本研究發現，HT-29、HCT-116、SW480 3 株結直腸癌細胞中均有USP22 表達，其中SW480 的表達量最高。

USP22 在細胞周期調控過程中起到重要作用。hSAGA 是轉錄輔助因子復合物，其通過組氨酸尾部的特異性氨基酸共價修飾（例如乙?；?、甲基化和去泛素化）將其轉錄復合物募集到其靶基因的啟動子以激活基因轉錄[15-16]。USP22 是hSAGA 的亞單位，可以引起組蛋白H2A 和H2B 的去泛素化和組蛋白H4 的乙酰化[17]。本研究使用RNAi 的方法探索抑制USP22對于結直腸癌細胞增殖的影響，結果發現USP22 表達量的減少可以增加G0/G1期的細胞比例，使結直腸癌細胞周期停滯在G0/G1期，從而抑制細胞的周期進程。此外，促進細胞周期進程[18]相關的CyclinB1、CDK2 蛋白的表達量也降低，而細胞周期負性調控因子p21[19]的表達量升高。p21 的表達量與細胞凋亡同樣密切相關，本研究也發現USP22 被抑制后可以增加結直腸癌細胞的凋亡比例，說明USP22 可以影響結直腸癌細胞的凋亡。

綜上所述，USP22 抑制后，能夠抑制結直腸癌細胞的增殖，其機制可能與抑制細胞周期進程，促進細胞凋亡有關。本研究結果可以為篩選USP22 作為治療結直腸癌的靶標提供理論依據，但具體的作用機制以及相關通路需要更進一步的研究。