水通道蛋白1和腫瘤壞死因子受體相關蛋白1在人腦膠質瘤中的表達及相關性*

盧家潮，壽記新，王冰冰，高海東

（鄭州大學第五附屬醫院 神經外科，河南 鄭州 450052）

腦膠質瘤又稱膠質細胞瘤或神經膠質瘤，其發病率在中樞神經系統腫瘤中居首位，且其惡性程度也高于其他顱內腫瘤，治療時間長、過程非常復雜、預后差，對人類生命健康造成巨大危害[1]。水通道蛋白1（Aquaporin-1, AQP1）作為一種鑲嵌在細胞膜又極其保守的蛋白，具有自身的跨膜轉運功能，轉運分子大小為28 kD，基因定位于人染色體7p14[2]。AQP1 主要定位于中樞神經系統腦室脈絡叢上皮細胞，發揮維持水通道及離子通道（c-GMP）平衡的雙重效應，與腦脊液生成、分泌有關[3]。研究表明[4-5]，AQP1 在間變性星形膠質細胞瘤和腫瘤供血血管內皮細胞表達上調，AQP1 mRNA 及蛋白表達隨腫瘤惡性程度增加而升高。腫瘤壞死因子受體相關蛋白1（TRAP1）也稱HSP75，是線粒體熱休克蛋白90（HSP90）的主要成員。穩定的TRAP1 蛋白由645 個氨基酸脫水縮合而成，并且擁有1 個三磷酸腺苷匹配區域，在該區域三磷酸腺苷以獨特的構象與γ 磷酸基團進行匹配，從而發揮作用[6]。在膠質瘤，線粒體作為腫瘤細胞的能量代謝中心，TRAP1 的高表達能改變線粒體的某些融合/ 分裂相關蛋白的表達，使腫瘤細胞處于高能量代謝狀態[7-8]。國外學者研究分析發現TRAP1 的表達與腫瘤直徑的大小、惡性程度的高低及有無轉移等密切相關，即腫瘤直徑越大、惡性程度越高伴隨遠處轉移者TRAP1 處于高表達狀態，同時發現TRAP1 過度表達增加神經膠質瘤患者死亡風險[9]。但AQP1 與TRAP1 在腦膠質瘤的表達水平及其相關性的研究，目前鮮有報道，本文旨在研究兩者在腦膠質瘤中的表達及其相關性，為實驗及臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年3月—2017年12月在鄭州大學第五附屬醫院神經外科病區的住院患者66 例，根據術前患者臨床表現及影像學資料，術后病理切片確診為腦膠質瘤。全部標本均為第1 次手術切除，且術前從未進行過任何放化療及免疫療法等治療。其中，男性38 例，女性28 例；年齡21～65 歲，平均53.7 歲；根據《WHO 中樞神經系統腫瘤組織學分類》（2007），將66 例患者分為低級別組（Ⅰ、Ⅱ級）（A 組）35 例和高級別組（Ⅲ、Ⅳ級）（B 組）31 例。另采集同期15 例行第三腦室底造瘺術及大腦內減壓術患者的正常腦組織作為對照組。所有獲取的標本在實驗前由家屬簽署知情同意書并得到本院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

AQP1、TRAP1 抗人單克隆抗體均購自上海優寧維生物科技股份有限公司，SP 試劑盒、DAB 顯色劑均購自上海哈靈生物科技有限公司，總RNA 提取試劑購自上海富衡生物科技有限公司。RNA 純度經微量紫外分光光度計檢測，A260/A280 在1.6～1.8 之間，滿足實驗要求。AQP1、TRAP1、β-actin 基因引物序列由Primer Premier 6.0 軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列：AQP1 正向5'-CGGATCCATGGCCAGCGAGTTCAAGAAG-3'，反向5'-GCTCTAGATTTGGGCTTCATCTCCACCCTG- 3'；TRAP1 正向5'-TTAGTAACATATGGCGCGCGAGCT GCGG-3'，反向5'-TTCCTCGAGTTAGTGTCGCTCCAGG GCCTT-3'；β-actin 正向5'-CGAGCTGGACATCCG CAAAT-3'，反向5'-GTGGCAGGTGGACAGCGAGC-3。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測AQP-1 與TRAP1 mRNA 的表達

cDNA 4μl，dNTP Mixture（2mmol/L）20μl，引物（10 μmol/L） 各2μl，10×Taq Buffer 5μl，Taq 酶1.5μl，dH2O 30.5μl，總容量65μl。AQP1：95℃預變性3min，92℃變性35 s，57.5℃退火30s，70℃延伸4min，共35 個循環，70℃最后延伸14min。TRAP1 反應條件：94℃預變性3min，95℃變性40s，56.8℃退火33s，72℃延伸8min，共35 個循環，72℃最后延伸12min。將RT-PCR 反應產物與1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓穩定在85V 電泳約52min，接著對電泳結果進行拍照保存，再經美國Eagle EYE Ⅱ型凝膠圖像軟件處理系統，用（目的基因的吸光度值）/（β-actin 吸光度值）代表目的基因的相對表達含量。

1.4 Western blotting 檢測AQP-1 與TRAP1 蛋白的表達

提取少量組織標本盡量碾碎后放進預冷的含1% PMSF 的RIPA 裂解液，按每孔約80μl 加入6 孔板，放置冰上50min 后吸取裂解液，溫度4℃下將裂解液以14000r/min 離心35min 后取上清液，BCA 蛋白檢測方法進行蛋白定量。AQP1、TRAP1 分別于10%及7% SDS-PAGE 分離，采用半干濕法轉至PVDF，常溫下用8%的脫脂牛奶隔離1h，分別加入一抗：小鼠抗人AQP1、TRAP1 抗體（Abcam 公司），工作濃度均為1：1000。二抗：HRP 結合的抗小鼠IgG 抗體（Zymed Laboratories Inc, 美國），工作濃度1：2000。ECL 化學 發光轉至X 射線膠片。采用美國Eagle EYE Ⅱ型凝膠圖像軟件處理系統測定目標蛋白和標準對照的吸光度，并以（目標蛋白吸光度值）/（標準對照吸光度值）作為目標蛋白半定量相對值。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，相關性采用Spearman 相關分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組AQP1 mRNA 及蛋白的表達情況

3 組AQP1 mRNA 及蛋白表達的比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，A 組、B 組AQP1 mRNA 和蛋白表達較對照組上調（P＜0.05），B 組AQP1 mRNA 和蛋白表達較A 組上調（P＜0.05）。見表1和圖1、2。

2.2 3 組TRAP1 mRNA 及蛋白的表達情況

3 組TRAP1 mRNA 及蛋白表達的比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，A組、B組TRAP1 mRNA和蛋白表達較對照組上調（P＜0.05），B 組TRAP1 mRNA 和蛋白表達較A 組上調（P＜0.05）。見表2和圖3、4。

表1 各組AQP1 mRNA 及蛋白表達的比較 （±s）

表1 各組AQP1 mRNA 及蛋白表達的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與A 組比較，P ＜0.05。

組別 n AQP1 mRNA AQP1 蛋白對照組 15 0.336±0.016 0.221±0.011 A 組 35 0.456±0.019① 0.460±0.022①B 組 31 0.783±0.021①② 0.799±0.020①②F 值 11.356 10.298 P 值 0.000 0.000

圖1 AQP1 mRNA 表達

圖2 AQP1 蛋白表達

2.3 AQP1 與TRAP1 表達的相關性

隨著AQP1 mRNA 及蛋白表達的增多，TRAP1表達也有逐漸增多的傾向，Spearman 相關分析顯示AQP1 mRNA 及蛋白表達和TRAP1 mRNA 及蛋白表達無相關性（rs=0.074 和0.058，P=0.065 和0.080）。

表2 3 組TRAP1 mRNA 及蛋白表達的比較 （±s）

表2 3 組TRAP1 mRNA 及蛋白表達的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與A 組比較，P ＜0.05。

組別 n TRAP1 mRNA TRAP1 蛋白對照組 15 0.175±0.021 0.204±0.049 A 組 35 0.464±0.039① 0.457±0.023①B 組 31 0.839±0.029①② 0.770±0.035①②F 值 7.255 7.707 P 值 0.000 0.000

圖3 TRAP1 mRNA 表達

圖4 TRAP1 蛋白表達

3 討論

目前，在中樞神經系統中原發性腦膠質瘤之所以難根治，根本原因是該類腫瘤擁有非常豐富的血供及具有高度侵襲的特性[10]，在中樞神經系統，AQP1 mRNA及蛋白表達主要在側腦室及第四腦室脈絡組織上，已 有學者研究證實，AQP1 mRNA 及蛋白表達與Na+-K+-ATP 酶定位一致，集中在于朝向腦脊液的頂質膜的 微絨毛的表面，據推測，這可能與腦脊液生成和分泌有關，并參與水和離子平衡調節[11]，本研究發現，AQP1在原發膠質瘤（低度惡性與高度惡性）中普遍表達，而惡性程度不同的膠質瘤AQP1 表達的特點不同，腫瘤內部AQP1 的表達高于瘤周組織或者正常組織，說明AQP1 的表達與原發膠質瘤的腫瘤特性有關，這與EL HINDY 等[12]在AQP1 與人類星形細胞瘤血管生成的相關性標本中觀察到的結果類似。而AQP1 在膠質瘤新生血管中的普遍表達則提示AQP1 的作用可能與膠質瘤的異常增殖和侵襲性生長有內在聯系。有文章報道[13]，TRAP1 在細胞運動調控中具有雙重作用，在抑制TRAP1 活性而激活細胞運動，即有大量的能量來源時可能會降低細胞的最大遷移潛能，靶向TRAP1治療可以選擇性地增強抗轉移治療的療效。WU 等[14]通過實驗證實，膠質母細胞瘤組織TRAP1 表達水平高于正常腦組織，使用藥物干擾TRAP1 轉錄與翻譯過程，可誘導細胞核分裂期（G2/M 期）阻滯，導致PKB 磷酸化活性降低，誘導有絲分裂失敗，降低腫瘤細胞增殖和遷移。本實驗結果顯示，A、B 組較對照組AQP1、TRAP1 mRNA 及蛋白表達強度上調，說明AQP1、TRAP1 與膠質瘤的發生與病理等均有密切關系；且AQP1 與TRAP1 的mRNA 和蛋白表達強度與膠質瘤的腫瘤分期具有一致性，即隨著腫瘤病理級別增加，AQP1、TRAP1 表達強度依次增強。但經Spearman相關分析后顯示AQP1 mRNA 及蛋白表達與TRAP1 mRNA 及蛋白表達無相關性。

綜上所述，AQP1、TRAP1 與人腦膠質瘤發病和進展關系密切，而兩者對膠質瘤的病理進展無協同作用。雖然該研究為深入研究膠質瘤的分子發病機制積累一定的實驗基礎，但要更深層次地認識膠質瘤仍需大樣本對比分析。