肺癌食管癌缺失基因1及其甲基化在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的表達研究*

蔣偉蓉，唐金勇，李云秋，鐘宇

（1.湖南岳陽職業(yè)技術學院，湖南 岳陽 414000；2.郴州市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 郴州 423000；3.湖南師范大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻喉科，湖南 長沙 410005）

鼻內(nèi)翻性乳頭狀 瘤（nasal inverted papilloma, NIP）是一種耳鼻喉科臨床中常見的良性腫瘤，具有局部發(fā)病、侵襲性強、易復發(fā)且易惡性變的特點[1]。5%的NIP 與鼻竇癌有關，因此探討NIP 的發(fā)病機制有助于其早期診斷及治療。肺癌食管癌缺失基因1（deleted in lung and esophagi cancer 1,DLEC1）是一個新的候選腫瘤抑制基因，研究發(fā)現(xiàn)DLEC1基因是一個良好的預后指標[2]。而增殖細胞核抗原Ki-67 是一種與細胞有絲分裂密切相關的抗原，能敏感而特異且較全面可靠地反映人體細胞增殖活性[3]。本研究通過檢測NIP組織中DLEC1表達及基因甲基化和Ki-67 的表達，探討DLEC1與NIP 發(fā)病及臨床病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2018年1月湖南師范大學附屬第一醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院）及郴州市第一人民醫(yī)院經(jīng)病理確診為鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤患者30例為NIP組。其中，男性14 例，女性16 例；年齡39～67 歲，平均51.8 歲。另選取同期鼻中隔偏曲矯正術患者20 例為對照組，取其正常中鼻甲黏膜組織。其中，男性12 例，女性8 例。所有組織標本常規(guī)石蠟包埋切片備用。

1.2 方法

1.2.1 試劑 石蠟包埋組織DNA 提取試劑盒購自美國Omega 公司，引物、Taq 酶、Gold View Ⅱ型核酸染色劑等購自大連寶生物工程有限公司，EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司，即用型EnVisionTMSupper/HRP 檢測試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2.2 NIP 組織中DLEC1和Ki-67 檢測 采用即用型EnVisionTMSupper/HRP檢測試劑盒檢測DLEC1和Ki-67 表達，操作步驟按試劑盒說明書進行。DLEC1在細胞核和/或細胞漿呈棕黃色為表達陽性，Ki-67 在細胞核呈棕黃色為表達陽性，于高倍顯微鏡下（×400）取5 個視野，依據(jù)染色細胞數(shù)及強弱分類及表達的細胞平均數(shù)所占百分比判定：＜5%為陰性，≥5%為陽性。

1.2.3DELC1甲基化檢測 采用DNA 提取試劑盒提取石蠟包埋組織中DNA，采用EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒，將組織DNA 取1μg 進行修飾；以上游2 000 bp 作為該基因啟動子區(qū)域設計引物，甲基化（M）引物序列，正向：5'-GATTATAGCGATGACGGGAT TC-3'，反向：5'-ACCCGACTAATAACGAAATTAACG- 3'；未甲基化（U）引物序列，正向：5'-TGATTATAGTGA TGATGGGATTTGA-3'，反向：5'-CCCAACTAATAACAA AATTAACACC-3'；擴增產(chǎn)物大小193 bp。PCR 反應 體系25 μl，反應條件根據(jù)文獻修改[4]。甲基化：95℃ 預變性10 min，40 個循環(huán)（94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸5 min，4℃；非甲基化：95℃預變性10 min，40 個循環(huán)（94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸5 min，4℃。取擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果。為保證檢測可靠性，采用反復多次檢測DLEC1均為甲基化陽性的肺腺癌A549 細胞DNA 為甲基化陽性對照，外周血單個核細胞DNA 標本為非甲基化陽性對照。產(chǎn)物電泳只出現(xiàn)非甲基化條帶，結(jié)果統(tǒng)計為非甲基化；出現(xiàn)甲基化條帶，則無論是否出現(xiàn)非甲基化條帶，均統(tǒng)計為甲基化。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用例（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組DLEC1 和Ki-67 的表達情況

NIP 組DLEC1失表達23 例（76.7%），對照組DLEC1失表達9 例（45.0%），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.223，P=0.022）；NIP 組Ki-67 陽性18 例（60.0%），對照組Ki-67 陽性2 例（10.0%），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.500，P=0.000）。見圖1。

圖1 兩組DLEC1 和Ki-67 的表達情況 （×400）

2.2 兩組DLEC1 啟動子甲基化水平

NIP 組DLEC1啟動子區(qū)CpG 島甲基化陽性檢出率為43.3%（13 例），對照組有10.0%（2 例）DLEC1啟動子區(qū)呈甲基化狀態(tài)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.349，P=0.012）。見圖2。

2.3 NIP 組DLEC1 與Ki-67 表達的關系

NIP 組DLEC1與Ki-67 的表達有關（χ2=5.660，P=0.017）。見表1。

圖2 兩組DLEC1 基因啟動子甲基化水平

表1 NIP 組DLEC1 與Ki-67 表達的相關性

3 討論

NIP 在1854年被首次報道[5]，是一種鼻腔和鼻旁竇的良性腫瘤，它有3 個主要特點[6-7]：局部相對高侵襲性、高復發(fā)率及可能在發(fā)病初或復發(fā)時發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤相關。目前，腫瘤的性質(zhì)及是否為鱗癌的癌前病變及發(fā)病機制仍不明確，這些特點使得其在臨床治療較為困難，因此對NIP 發(fā)病機制的研究具有重要的臨床意義。

有研究[8-10]認為，其發(fā)病可能與HPV 感染有關，HPV 感染易引起組織細胞增殖，Ki-67 為增殖性核抗原標志物，在除G0期細胞，Ki-67 在所有G1、S、G2和M 期細胞中均有表達，且在許多惡性腫瘤中的表達多與腫瘤活躍、病理分期及早期復發(fā)有關。本研究中發(fā)現(xiàn)NIP 組Ki-67 表達高于對照組，與其他研究結(jié)果類似，說明在NIP 中存在組織增生。

許多標志物[11-12]如橋粒芯蛋白3 和表皮生長因子受體等與NIP 有關，但NIP 惡性轉(zhuǎn)化的確切機制尚不清楚，有研究者[13]曾對口腔鱗癌及癌前病變黏膜白斑中DLEC1的表達及機制進行研究，發(fā)現(xiàn)DLEC1在口腔鱗癌中表達受抑制，且其抑制程度與腫瘤浸潤深度相關。DLEC1表達從正常組織到黏膜白斑到鱗癌依次減弱。DLEC1[14]定位于3p22～p21.3，因已證實其在肝癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、口腔鱗癌和腎細胞癌組織中表達下調(diào)，因而被鑒定為候選抑癌基因[15-18]。該基因包含37 個外顯子，是一種相對較新的基因，其3p 位點是幾個抑癌基因的著名位點。

DLEC1通過表觀遺傳改變而受抑制，其表達方式與表觀遺傳相關，受啟動子CpG 高甲基化組蛋白有或無去乙酰化而被調(diào)控[19]。有研究在胃癌和結(jié)腸癌細胞系中再引入DLEC1可抑制腫瘤細胞克隆。而在多個腫瘤中發(fā)現(xiàn)DLEC1活性被抑制，可能是通過影響DLEC1啟動子甲基化而實現(xiàn)[20]。其他研究[21]發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌中DLEC1可誘導細胞周期G1期阻滯，本研究發(fā)現(xiàn)NIP 組DLEC1失表達高于對照組，NIP 組DLEC1與Ki-67 表達有關，NIP 組DLEC1啟動子區(qū)CpG 島甲基化陽性檢出率高于對照組，提示在NIP 中DLEC1基因受抑制，其發(fā)病可能與其有關。

綜上所述，DLEC1表達缺失可能與NIP 的發(fā)病相關，通過DLEC1啟動子區(qū)CpG 島甲基化造成基因在NIP 中失表達，并與Ki-67 協(xié)同，引起NIP 組織異常增殖而發(fā)病。DLEC1可能成為治療NIP 并防止其復發(fā)的新的治療靶點。