乳腺癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞和外泌體的表達(dá)及其臨床意義*

吳瑛，譚鑫，吳芳蘭，袁鯤，賈曉敏

（1.長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005；2.拉薩市人民醫(yī)院 病理科，西藏 拉薩 850000）

乳腺癌是臨床常見(jiàn)的疾病，是女性死于癌癥的第2 大病因，臨床上一直在尋找更好的檢測(cè)指標(biāo)，以便早期診斷乳腺癌，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的目的。外周血一直是臨床可供實(shí)時(shí)檢測(cè)的樣本，有助于進(jìn)行實(shí)時(shí)的“液體活檢”[1]。乳腺癌傳統(tǒng)的檢測(cè)指標(biāo)很多，如癌胚抗原、糖類(lèi)抗原Ca 27.59 等，但由于缺乏足夠權(quán)威的證據(jù)支持，并未被推薦應(yīng)用于乳腺癌早期診斷及術(shù)后隨訪復(fù)查[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs）與外泌體近年來(lái)被認(rèn)為是臨床應(yīng)用前景最好的液體活檢指標(biāo)[3-4]。因此本研究選擇CTCs 和microRNA-1246（miR-1246）作為檢測(cè)指標(biāo)，探討其在乳腺癌患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月—2018年10月長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院乳腺癌、乳腺良性腫瘤及健康體檢者。乳腺癌患者87 例（乳腺癌組）。年齡（37±11）歲，均行病理檢查確診，術(shù)前未接受放射及化學(xué)治療，常規(guī)體檢并排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。收集同期乳腺良性腫瘤患者40 例（乳腺良性腫瘤組），排除身體其他部位惡性腫瘤。年齡（32±6）歲；其中乳腺纖維腺瘤29 例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤11 例。收集同期健康體檢者20 例（健康組）。均為單純?nèi)橄僭錾挲g（31±4）歲。3 組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本取樣 所有患者及健康體檢者取清晨空腹靜脈血2 份，1 份5 ml 室溫靜置約20 min，取上清液于1.5 ml EP 管內(nèi)，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆茫? 份 7.5 ml，進(jìn)行異常細(xì)胞分離。

1.2.2 檢測(cè)外周血中CTCs 取患者外周血7.5 ml，2 h 內(nèi)采用美國(guó)強(qiáng)生公司Cell Search 系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)及結(jié)果分析，CTCs 判斷標(biāo)準(zhǔn)為[5]：①細(xì)胞外形異常，大小不一，細(xì)胞長(zhǎng)徑＞10 μm；②細(xì)胞核大且異形，核質(zhì)比＞1；③上皮細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞角蛋白、DAPI 均為陽(yáng)性，且CD45 陰性。CTCs ≥1 為陽(yáng)性。CTCs ≥5 個(gè)提示乳腺癌可能。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 檢測(cè)各組外周血中miR-1246 表達(dá) 取400 μl 血清置入1.5 ml EP 管，加入44 μl 10%聚乙二醇，于4℃冰箱靜置2 h，4℃ 5 000 r/min 離心10 min，收集沉淀物。用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，4℃ 5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，往沉淀物中加入20 μl裂解液。按照試劑盒步驟合成cDNA，反應(yīng)體系：RNA 模板5 μl，引物、內(nèi)參（U6）各2 μl，混合酶1 μl，5× 緩沖液4 μl，焦炭酸二乙酯水6 μl。引物序列由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。miRNA-1246：正向5'-ACACTCCAGCTGGGAATGGATTTTTGG-3', 反向5'-ACTGACTGATGATGCAATCTCAACTGGTGTC GTGGA-3'；內(nèi)參引物序列：正向5'-ATTGGAACGATA CAGAGAAGATT-3', 反向5'-GGAACGCTTCAGAAT TG-3'；逆轉(zhuǎn)錄體系20 μl，反應(yīng)條件：37℃下逆轉(zhuǎn)錄2 h，95℃下金屬浴5 min，置入-20℃冰箱冷凍保存。采用美國(guó)Applied Biosystemes 公司ABI PRISM 7300 qRT-PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40 個(gè)循環(huán)。美國(guó)賽默飛科技公司連續(xù)光譜熒光酶標(biāo)儀自動(dòng)進(jìn)行樣本檢測(cè)，結(jié)果＜103copy/ml 為陰性，≥103copy/ml 為陽(yáng)性。根據(jù)樣品qRT-PCR 曲線得到Ct 值，ΔCt=CtmiRNA-CtU6；ΔΔCt=Ct乳腺癌-Ct對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；方差齊性檢驗(yàn)采用F檢驗(yàn)，比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)計(jì)算外周血中CTCs 和miR-1246 對(duì)乳腺癌診斷的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性、陽(yáng)性似然比（positive likelihood ratio, PLR）和陰性似然比（negative likelihood ratio, NLR）等評(píng)估診斷結(jié)果。診斷符合率=CTCs 或miR-1246或CTCs+miR-1246 陽(yáng)性例數(shù)/病理陽(yáng)性例數(shù)。應(yīng)用Kappa 檢驗(yàn)評(píng)估診斷一致性，若0.75＜κ ≤1.00，說(shuō)明一致性極好；0.40＜κ ≤0.75，一致性好；0.00 ≤κ ≤ 0.40，則一致性差。

2 結(jié)果

2.1 3 組外周血中CTCs 和miR-1246 表達(dá)情況

3 組外周血中CTCs 和miR-1246 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血清miR-1246 界值為98.32。見(jiàn)表1。

表1 3 組外周血中CTCs 和miR-1246 表達(dá) （±s）

表1 3 組外周血中CTCs 和miR-1246 表達(dá) （±s）

組別 n CTCs（個(gè)/ml） miR-1246乳腺癌組 87 4.36±1.08 102.94±43.28良性乳腺腫瘤組 40 1.22±0.94 70.33±16.52健康組 20 0.63±0.09 47.61±10.85 F 值 1.287 6.385 P 值 0.000 0.000

2.2 乳腺癌患者外周血中CTCs 和miR-1246 診斷符合率比較

外周血中CTCs 與miR-1246 診斷乳腺癌的符合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.458，P=0.499）；CTCs、miR-1246 及CTCs 聯(lián)合miR-1246 三者診 斷 乳 腺 癌的符合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.378，P=0.041）。miR-1246 與CTCs 聯(lián)合miR-1246 診斷乳腺癌的符合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.365，P=0.007）；CTCs 與CTCs 聯(lián)合miR-1246 診斷乳腺癌的符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.738，P=0.053）。見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌患者外周血中CTCs 和miR-1246 診斷符合率 例（%）

2.3 乳腺癌患者外周血中CTCs 和miR-1246 診斷乳腺癌結(jié)果比較

以病理活檢為金標(biāo)準(zhǔn)，外周血中CTCs 診斷敏感性為69.0%，特異性為75.0%。外周血中CTCs 診斷乳腺癌的κ 值為0.34＜0.40，表示一致性較差；外周血中miR-1246 診斷乳腺癌敏感性為63.2%，特異性為79.2%。經(jīng)Kappa 檢驗(yàn)評(píng)估血miR-1246 診斷乳腺癌κ 值為0.29＜0.40，表示一致性較差。外周血中CTCs聯(lián)合miR-1246 診斷乳腺癌敏感性為81.6%，特異性為70.8%。經(jīng)Kappa 檢驗(yàn)評(píng)估血CTCs 聯(lián)合miR-1246診斷乳腺癌κ 值為0.46＞0.40，表示具有較好的一致性。見(jiàn)表3。

表3 乳腺癌患者外周血中CTCs 和miR-1246 診斷乳腺癌的結(jié)果

3 討論

早期乳腺癌的5年生存期遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于晚期浸潤(rùn)性乳腺癌，早期發(fā)現(xiàn)是改善乳腺癌預(yù)后的關(guān)鍵因素。液體活檢是指采用無(wú)創(chuàng)方法提取患者的體液（血液、尿液、唾液和乳汁等），并分析其中的腫瘤組織衍生的生物學(xué)標(biāo)志物：如CTCs、循環(huán)腫瘤DNA 和外泌體等[6]。因?yàn)橥庵苎梢宰鳛橹貜?fù)采集且隨時(shí)提取，相對(duì)無(wú)法多次重復(fù)取材的腫瘤組織，可以做到實(shí)時(shí)液體活檢，用來(lái)識(shí)別早期乳腺癌。相當(dāng)多的證據(jù)表明轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是由原發(fā)腫瘤中具有侵襲血流能力的細(xì)胞介導(dǎo)，血液中的CTCs 是其中具有重要意義的細(xì)胞成分，可以在骨、肺、肝或腦中形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之前，傳播到較遠(yuǎn)的部位，是疾病擴(kuò)散的主要載體之一。CTCs 有望成為所有疾病階段的一種強(qiáng)大的非侵入性實(shí)時(shí)可測(cè)量生物標(biāo)志物[7-8]。但CTCs 比較少見(jiàn)，且不易被發(fā)現(xiàn)，在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)，加上其表達(dá)一些分子和細(xì)胞特征，嚴(yán)重妨礙研究和開(kāi)發(fā)[9]。外周血中收集到的CTCs 數(shù)量少，且不可避免地會(huì)受到循環(huán)白細(xì)胞的污染[10-11]。JANNI等[12]發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性乳腺癌患者中，CTCs 是疾病緩解不佳、無(wú)病生存不良等的預(yù)測(cè)因素，雖然亦有明確的證據(jù)顯示轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血CTCs 與預(yù)后相關(guān)，但在初次診斷時(shí)CTCs 與預(yù)后相關(guān)性研究較少。

外泌體是一種小的分泌囊泡，是內(nèi)質(zhì)體來(lái)源的納米（50～150 nm）大小囊泡，由多種細(xì)胞類(lèi)型分泌，含有細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和miRNA，被認(rèn)為在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。在乳腺癌中，通過(guò)蛋白質(zhì)和mRNA 等多種生物活性分子的水平轉(zhuǎn)移，而逐漸成為局部或系統(tǒng)細(xì)胞間腫瘤信息傳導(dǎo)媒介并在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[13-14]。外泌體選擇性地包裹著表明其細(xì)胞來(lái)源的miRNA[15]。miRNA 因其腫瘤特異性表達(dá)譜而成為癌癥發(fā)生和發(fā)展中有前途的生物標(biāo)志物，浸潤(rùn)前和浸潤(rùn)期乳腺癌組織和晚期乳腺癌患者血清中均有常見(jiàn)的miRNA 表達(dá)，且培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞或?qū)Ч芄嘞礃?biāo)本外泌體中含有的某些miRNA 與正常乳腺上皮細(xì)胞分泌的不同。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌外泌體中miRNA 具有獨(dú)特的惡性特征，可作為乳腺癌的循環(huán)生物標(biāo)志物，事實(shí)上，很多研究均對(duì)這種可能性進(jìn)行評(píng)估，現(xiàn)在的研究理論認(rèn)為循環(huán)miRNA，無(wú)論是在膜結(jié)合的囊泡內(nèi)，還是與蛋白復(fù)合物相關(guān)，miRNA 均有不同的群體，這些群體可能來(lái)源于不同的細(xì)胞類(lèi)型，反映不同的釋放機(jī)制。但由于血液中miRNA 存在種群內(nèi)在異質(zhì)性，因而尚未確定乳腺癌組織和血清/血漿中異常表達(dá)的循環(huán)miRNA，亦無(wú)法確定其生物標(biāo)志物。因而選擇合適的外泌體miRNA 極為重要。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，miR-21和miR-1246 等微小RNA 在人乳腺癌外泌體中選擇性富集，在乳腺癌血漿中顯著升高。且發(fā)現(xiàn)攜帶miRNA的外泌體可以通過(guò)直接攝取在不同細(xì)胞系之間轉(zhuǎn)移。miR-1246 在轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中較非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞或非惡性乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)，本研究中證實(shí)miR-1246 和CTCs 在外周血中表達(dá)高于良性乳腺腫瘤和健康組，miR-1246 聯(lián)合CTCs 檢測(cè)與病理檢測(cè)符合率較好。

綜上所述，外周血中CTCs 與miR-1246 聯(lián)合檢測(cè)有助于早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌。miR-1246 和CTCs 可能作為乳腺癌標(biāo)志物的候選分子，是乳腺癌中有前途的生物標(biāo)志物。