丙型肝炎病毒單基因型感染與非單基因感染患者基因型分析

石玉如，岳莉，姚余有，趙長城，谷妍，劉楊，王云，戚應杰

（1.安徽省立醫院感染病院，安徽 合肥 230022；2.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）屬于黃病毒科肝炎病毒屬，是引起全球慢性丙型肝炎、肝硬化甚至肝細胞癌的重要因素之一[1-2]。HCV 基因組為單股正鏈RNA，易變異，目前可分為7 種基因型及數十種不同的基因亞型[3]。據文獻報道，不同HCV 的基因分型在臨床診斷、治療和預后康復方面具有重要的意義[4-5]。為討論不同HCV 基因分型與HCV 載量、肝功能、凝血及自身抗體之間的關系，本文對114 例HCV 基因型分布及相關血清學指標進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年7月—2018年4月安徽省立醫院感染病院接診的慢性丙型肝炎患者114 例。其中，男性53 例，女性61 例；平均年齡51.8 歲。入選患者均符合我國2015年版《丙型肝炎防治指南》[6]的診斷標準，通過相關檢測，排除其他血液病及肝炎重疊感染病例。

1.2 儀器與試劑

美國應用生物系統公司ABI-7300 基因擴增儀，廈門安普利生物工程有限公司9800 全自動醫用PCR系統及全自動核酸提取工作站，日本日立公司7180生化分析儀，北京賽科希德科技股份有限公司SF-8100 血凝儀、邁瑞醫療國際有限公司BC-6900 全自動血球儀，江蘇浩歐博生物醫藥股份有限公司全自動化學發光納米磁微粒自身抗體檢測儀。丙型肝炎分型核酸提取試劑及基因分型檢測試劑盒由泰普生物科學（中國）有限公司提供，其余試劑均選用原廠配套試劑。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本準備 收集患者空腹靜脈血4 份，每份5ml。其中2 份血樣置于促凝管中，經4000r/min 離心10min，取上層血清分別用于HCV-RNA 含量、HCV 基因型檢測、肝功能指標檢測以及自身抗體檢測；另外1 份血樣置于枸櫞酸鈉抗凝管中，經3000r/min 離心8min，取上層血漿用于凝血酶原時間（PT）、凝血酶 原活動度（PTA）檢測；最后1 份血樣置于EDTA 抗凝管中，混勻后用于血細胞計數測定。

1.3.2 HCV 基因分型檢測 HCV-RNA 提取采用硅膠膜過柱純化技術，從血清樣本中提取病毒RNA，提取后的RNA 運用一步法逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）技術和Taqman 探針技術，實時檢測熒光信號，可判斷樣本為HCV 1b、2a、3a、3b 和6a 亞型單獨感染或混合感染，試劑盒檢測下限為1000copy/ml。

1.3.3 HCV-RNA 定量檢測 HCV-RNA 提取采用安普利全自動核酸提取工作站及配套試劑，提取后的RNA，利用安普利9800 全自動醫用PCR 系統進行定量分析。線性范圍為1×102～5×107copy/ml；定量結果超過線性范圍（＞5×107copy/ml）以5×107copy/ml計算。

1.3.4 相關血清學指標檢測 肝功能檢測：谷氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、γ-谷氨酰轉移酶（GGT）；凝血功能檢測：PT、PTA、血小板（PLT）；自身抗體檢測：抗核抗體（ANA）、抗U1 小核糖核蛋白抗體（抗RNP）、抗狼瘡細胞抗體（抗Sm）、抗52 kD 的多肽條段（抗Ro-52）、著絲粒蛋白B 抗體（抗CENP B）、M2 型線粒體抗體（AMA-M2）、抗肝/腎微粒體1 型抗體（LKM1）均按廠家說明書進行操作，上機檢測，質控均在控。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料以中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，比較用秩和檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCV 基因分布情況

對114例丙型肝炎患者HCV進行基因分型。其中，1b 型92 例，占80.70%；2a 型8 例，占7.01%；6a 型2 例，占1.75%；2a+6a 型5 例，占4.39%；3a+3b 型6例，占5.26%；未分型1 例，占0.88%（見圖1）。單基因型102 例，非單基因型11 例，未分型1 例。

2.2 HCV 基因分型與HCV-RNA 病毒載量的比較

單基因型組與非單基因型組HCV-RNA 比較，差異無統計學意義（Z=0.343，P=0.732）。見表1。

2.3 HCV 單基因型感染患者與非單基因型感染患者相關肝功能指標的比較

HCV 單基因型感染患者與非單基因型感染患者ALT 結果比較，差異有統計學意義（P＜0.05），非單基因型組比單基因型感染患者高。而兩者AST 與GGT比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 HCV 單基因型感染患者與非單基因型感染患者相關凝血指標的比較

單基因型感染患者與非單基因型感染患者PLT、PT、PTA 結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 HCV 基因分布圖

表1 不同基因型HCV 病毒載量的比較 [copy/ml，M（P25，P75）]

表2 單基因型感染與非單基因型感染患者的相關肝功能指標的比較 [IU/L，M（P25，P75）]

表3 單基因型感染與非單基因型感染患者的相關凝血指標的比較 M（P25，P75）

2.5 HCV 單基因型與非單基因型感染患者自身免疫抗體的比較

只要有一個自身抗體指標為陽性的患者，就將其定義為陽性。結果顯示：單基因組陽性率4.9%（5/102）與非單基因組陽性率36.4%（4/11）比較，差異有統計學意義（χ2=13.408，P=0.000）。

另外，對114 例樣本進行自身免疫抗體分析后發現，單基因型組以抗R0-52 為主，占陽性率的25%，非單基因型組以抗CENPB 為主，占陽性率的40%。

3 討論

全球范圍內，HCV 的感染率為3.8%。我國HCV的感染率約為3.2%[7]。由于HCV基因具有高度變異性，不同基因型其治療方案、療效、療程和預后相差很大，據相關文獻報道，1b 亞型患者中進展為肝硬化和肝癌的比例高于其他基因型[8]，并且對干擾素的反應不如2、3 型好，更易發展為慢性[9]。因此，HCV 基因分型檢測意義重大。

在我國HCV 基因型分布呈多樣化特征，其中1b較為常見，2a 次之[10]，這與本研究結果相似。可能與地域分布及感染途徑有關，SILBERSTEIN[11]研究發現1b 通過輸血傳播，在全球范圍的感染率很高，70%以上為HCV 感染患者；2a 和2b 占全球感染患者的10%～30%，主要分布在北美、歐洲和日本；1a 基因型與靜脈注射毒品有關，主要分布在美國和歐洲。另外，本研究的114 例慢性丙型肝炎患者中，發現11 例非單基因型感染、102 例單基因型感染和1 例未分型。單基因型與非單基因型患者血清中HCV-RNA 濃度無差異，這與SCHIJMAN 等[12]研究一致。表明HCVRNA 濃度高低與是否被HCV 單基因型還是非單基因型感染無關。

肝功能是反映肝臟損害的最靈敏的指標之一。其中ALT、AST、GGT 是應用最多的肝臟代謝酶，其水平越高，肝臟組織損傷程度也就越嚴重。本研究通過對單基因型和非單基因型患者血清的ALT、AST、GGT 水平比較，發現HCV 非單基因型患者ALT 要高于單基因型，而AST、GGT 水平無差異，這可能是由于ALT 存在于胞質內，在肝細胞受到破壞后更易進入血循環中而被檢測到。AST 位于線粒體內，需要進一步的破壞才會釋放入血。而GGT，當肝細胞受損時，細胞膜通透性增加，GGT 釋放出來，但是其敏感性依然不及ALT[13]。

肝臟是產生凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ和X Ⅲ的場所。當肝臟受損，會造成這些凝血因子減少；同時HCV 刺激機體免疫應答產生的免疫復合物會直接或間接損害造血干細胞，也會造成血小板計數偏低[14]，從而影響機體凝血功能。本研究顯示，HCV 單基因型和非單基因型之間，凝血功能無差異，表明HCV基因分型與肝臟凝血功能無關。有研究指出，這可能與丙型肝炎的發病機制有關[15]。

相關文獻報道，病毒性肝炎患者血清中存在多種自身抗體，其中又以乙型肝炎、丙型肝炎多見，自身抗體中則以ANA 為主。對病毒性肝炎患者進行自身抗體檢測有助于了解患者機體免疫狀況，以便指導臨床用藥[16]。楊建軍等[17]指出，Ib 型患者自身抗體陽性率高于其他型。同時國外研究學者KIRDAR 等[18]報道，Ⅰ型HCV 與自身免疫相關，Ⅰ型HCV 感染者ANA、ASMA、AMA 和LKM 分別占50.0%、16.7%、25.0%和8.3%，Ⅱ型感染者除ANA 外，均未檢測到ASMA、AMA 和LKM。Ⅲ、Ⅳ型未檢測到自身抗體。本研究發現HCV 非單基因型自身免疫抗體的檢出率要高于單基因型。可能是由于自身免疫是HCV 損傷機體的一個重要方面[19]，HCV 感染會引發免疫應答的產生[20]。而非單基因型病毒感染，更容易產生自身免疫抗體，給機體造成更強的免疫應答機制。同時本研究發現，單基因型以R0-52 為主，非單基因型以CENPB 為主。究其原因，還有待擴大樣本量進行進一步研究。

綜上所述，丙型肝炎分型對丙型肝炎的治療，以及判斷預后具有重要的意義。本地區以單基因型Ⅰb為主，但是非單基因型對肝臟的損傷及引起的自身免疫應答，應給予足夠的重視。