pH及離子強度對燕麥分離蛋白功能特性及亞基特性的影響

王美玉 王 愈 陳振家 閆 舟 劉龍龍

(1. 山西農業大學，山西 晉中 030801；2. 山西省農業科學院農作物品種資源研究所，山西 太原 030031)

貯藏蛋白是多數植物種子的主要蛋白質，在種子萌發過程中作為氮、硫和碳水化合物的來源。貯藏蛋白主要分為球蛋白和醇溶蛋白，雙子葉植物種子的主要貯藏蛋白質為球蛋白，而單子葉植物則為醇溶蛋白，多數谷物種子的主要貯藏蛋白質為醇溶蛋白，而燕麥和大米只含有少量的醇溶蛋白胺(5%～10%)，其主要貯藏蛋白為球蛋白[1]，并與雙子葉植物中的11S球蛋白相似，有研究[2]表明燕麥和大米貯藏蛋白在水中的溶解性比雙子葉植物的差，燕麥球蛋白的溶解需要0.8～1.0 mol/L的NaCl，而水稻球蛋白的溶解需要變性溶劑。燕麥球蛋白含量高，占燕麥總蛋白含量的50%～80%，氨基酸比例合理，其中賴氨酸含量為4.2%，高于除大米以外的其他谷物[3]，因此近年來受到廣泛關注。

影響蛋白質溶解度的因素有pH、離子強度、溶劑類型及溫度。Ma等[4]研究表明，在極端酸性或堿性條件下，β-折疊結構(1 626，1 634，1 682 cm-1)條帶向更高或更低的波數移動，表明構象發生了變化；在一定的鹽濃度下，1 626，1 634 cm-1譜帶向上移動，1 634 cm-1峰強度明顯減小。球蛋白組分呈U型溶解度曲線，在pH 6～7時溶解度最小；在曲線的酸性、堿性端，溶解度均達到90%以上[5]。前期研究[6]發現，高鹽離子強度下燕麥球蛋白有更高的溶解性，而球蛋白為燕麥分離蛋白的主要成分。

在前人研究的基礎上，試驗擬擴大pH及離子強度范圍，研究燕麥分離蛋白的功能特性及亞基特性，利用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)從亞基角度解釋不同pH及離子強度下，可溶性燕麥分離蛋白的亞基特性及其與部分功能特性之間的關系，旨在為燕麥分離蛋白的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥：壩莜一號，山西農業科學院；

氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

考馬斯亮藍G250、30%制膠劑、四甲基乙二胺、SDS、甘油、低分子量蛋白質Marker：分析純，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外—可見分光光度計：UV-1200型，上海美譜達儀器有限公司；

pH計：ST3100型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

磁力加熱攪拌器：791型，金壇市科析儀器有限公司；

高速離心機：HC-2064型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

電泳儀：DYY-7C型，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 燕麥分離蛋白的制備 根據文獻[7]修改如下，挑選籽粒飽滿，無病蟲害的燕麥磨粉，燕麥粉與石油醚按1∶5(g/mL)混合攪拌過夜，然后經抽濾、晾干除去石油醚即為燕麥脫脂粉。燕麥脫脂粉與水按1∶10(g/mL)混合并調節pH為9.0，50 ℃下恒溫提取2 h， 4 000 r/min離心15 min，取上清液，調節上清液pH為5.0，4 000 r/min離心15 min，沉淀勻漿后調節pH至中性，經真空冷凍干燥，即為燕麥分離蛋白(含量為80.3%)。

1.3.2 不同pH及離子強度下可溶性燕麥分離蛋白濃度的測定 配制質量分數為1%的燕麥分離蛋白溶液，攪拌0.5 h，用1 mol/L HCl及NaOH溶液分別調節pH至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，加入NaCl溶液分別配成濃度梯度為0.01，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 mol/L的溶液，攪拌15 min，10 000 r/min離心10 min，上清液用考馬斯亮藍法[8]測定蛋白質含量。

1.3.3 起泡性及泡沫穩定性的測定 參照何幗英等[9]方法，略作修改。配制質量分數5%的燕麥分離蛋白溶液，攪拌0.5 h。用1 mol/L HCl及NaOH溶液調節為不同pH；加入NaCl調節為不同離子強度，分別取10 mL蛋白溶液，13 500 r/min均質2 min，分別記錄均質停止時及放置30 min后泡沫的體積。按式(1)、(2)計算起泡性及泡沫穩定性。

(1)

(2)

式中：

FA——起泡性，%；

FS——泡沫穩定性，%；

V0——攪打停止時泡沫總體積，mL；

V——攪打前液體體積，mL；

V30——放置30 min后泡沫體積，mL。

1.3.4 乳化性及乳化穩定性的測定 參照管驍等[10]方法，略作修改。配制質量分數1%的燕麥分離蛋白溶液，攪拌0.5 h。用1 mol/L HCl及NaOH溶液調節為不同pH；加入NaCl調節為不同離子強度，分別取15 mL蛋白溶液與5 mL大豆油混合，13 500 r/min均質2 min。分別從瓶底取20 μL均質停止時及放置30 min后的乳濁液，與5 mL SDS(0.1%，質量分數)溶液混合，在500 nm下測定吸光值(以SDS溶液為空白)。按式(3)、(4)計算乳化性及乳化穩定性。

(3)

(4)

式中：

EAI——乳化性，m2/g；

ESI——乳化穩定性，min；

A0——初始乳化液吸光值；

C——樣品濃度，g/mL；

φ——乳化液中油相的比例；

L——比色杯光徑，mm；

N——稀釋倍數；

A30——30 min后乳化液的吸光值。

1.3.5 SDS-PAGE 根據文獻[11]略作修改，取1.3.2中離心所得上清液進行電泳試驗，濃縮膠與分離膠濃度分別為5%，12%，樣品上樣量6 μL，恒壓電泳，電流40 mA，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓150 V。電泳結束后，電泳膠片固定3 h，再通過染色，脫色，最后成像儀成像。

1.4 數據處理

試驗重復3次，使用Excel 2010和Origin 8.0進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 pH與離子強度對燕麥分離蛋白溶解性的影響

由圖1可知，燕麥分離蛋白溶解度呈U型曲線，pH在5.0～6.0(等電點)時，溶解度最低，與管驍等[5，10]研究結果相近，而許英一等[12]則認為pH為4.0時燕麥分離蛋白溶解度最低，但pH為6.0時其溶解度同樣也較低，可能是由于原料或提取條件的不同造成的。因此，燕麥分離蛋白在pH 5.0～6.0缺乏靜電排斥作用，蛋白質—蛋白質之間的疏水相互作用遠大于帶電殘基產生的親水性和水合作用，燕麥分離蛋白此時幾乎完全不溶解，而在堿性pH下具有較高的溶解度。

圖1 pH對燕麥分離蛋白溶解特性的影響

由圖2可知，添加鹽離子(<0.05 mol/L)會使燕麥分離蛋白的溶解度降低，表現為鹽析，一方面為燕麥分離蛋白含有較高比例的非極性區域，降低了溶解度[13]，另一方面為少量鹽離子與水分子相互作用，減少了燕麥分離蛋白表面親水基團與水分子間的相互作用[14]，促進蛋白質—蛋白質相互作用，使蛋白質分子間發生聚集，導致溶解性降低。繼續添加鹽離子，燕麥分離蛋白的溶解度逐漸升高，表現為鹽溶，與Hari等[2]的報道一致，與大豆蛋白溶解特性相反[15]。燕麥球蛋白在酸性多肽的C末端附近含有8個富含谷氨酰胺的氨基酸重復序列(大豆球蛋白中該區域由不同長度的酸性殘基組成)，該區域位于球蛋白表面，暴露于溶劑，與其他球蛋白相比，燕麥球蛋白的親水性較低，部分解釋了燕麥球蛋白溶解度所需的鹽濃度較高[16]。

圖2 離子強度對燕麥分離蛋白溶解特性的影響

Figure 2 Effect of ionic strength on the dissolution characteristics of oat protein isolate

2.2 pH與離子強度對燕麥分離蛋白起泡性的影響

由圖3可知，燕麥分離蛋白在等電點(pH 5.0～6.0)時起泡性最差，泡沫僅由蛋白質的可溶部分參與形成，但泡沫最為穩定，與Guan等[17]的研究一致。等電點時，蛋白質—蛋白質間缺乏靜電排斥相互作用，有利于界面上的蛋白質—蛋白質相互作用及形成黏稠的膜。

圖3 pH對燕麥分離蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

由圖4可知，加入鹽離子后燕麥分離蛋白起泡性明顯降低。當NaCl濃度<0.1 mol/L 時，燕麥分離蛋白的起泡性隨鹽離子濃度的增加而降低，可能是NaCl對燕麥分離蛋白的鹽析作用；當NaCl濃度>0.1 mol/L 時，隨著鹽離子濃度的進一步增加，燕麥分離蛋白的起泡性迅速下降并趨于平緩，可能是燕麥分離蛋白對NaCl的鹽溶作用；當NaCl濃度達到0.8 mol/L時，燕麥分離蛋白表現出良好的起泡性，與何幗英等[18]的研究結果相近。不同離子強度下，燕麥分離蛋白的泡沫穩定性先上升后下降，隨后趨于平緩。當NaCl濃度為0.1 mol/L時，燕麥分離蛋白泡沫穩定性最佳，當NaCl濃度≥0.2 mol/L時，隨離子強度的增加，泡沫穩定性無明顯變化。

圖4 離子強度對燕麥分離蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

Figure 4 Effects of different ionic strength on foaming and foam stability of oat protein isolate

2.3 pH與離子強度對燕麥分離蛋白乳化性的影響

由圖5可知，在等電點附近，由于蛋白微溶且缺乏靜電排斥力，燕麥分離蛋白乳化性較差，在堿性條件下，燕麥分離蛋白表現出了良好的乳化性，與Guan等[17]的研究一致。在酸性和中性條件下，乳化穩定性變化趨勢與乳化性變化趨勢相反；而堿性條件下，乳化性與乳化穩定性變化趨勢相同，在一定范圍內隨pH的增加，乳化性及乳化穩定性均不斷升高。

圖5 pH對燕麥分離蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

由圖6可知，鹽離子的添加整體降低了燕麥分離蛋白的乳化性能。當NaCl濃度<0.2 mol/L時，燕麥分離蛋白的乳化活性隨鹽離子濃度的增加而降低，NaCl濃度為0.2 mol/L時，乳化性最差；當NaCl濃度>0.2 mol/L時，乳化性先上升后下降，NaCl濃度為0.7 mol/L 時乳化性最佳，與何幗英等[18]研究結果相近。乳化穩定性變化趨勢與乳化性相反，NaCl濃度為0.3 mol/L時乳化穩定性最高。

圖6 離子強度對燕麥分離蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

Figure 6 Effect of different ionic strength on emulsifying and emulsifying stability of oat protein isolate

2.4 SDS-PAGE

由圖7可知，當蛋白質在中性pH附近時，靜電排斥能量小于其他穩定蛋白質相互作用的能量，因此大部分蛋白較為穩定；在極端pH時，高靜電荷引起的強烈的分子內靜電排斥力導致蛋白質分子的腫脹和展開。在堿性條件下，可溶性燕麥分離蛋白亞基之間無明顯區別，可能是由于其中含有少量的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)[19]殘基。而酸性條件對可溶性燕麥分離蛋白亞基影響較大，pH由2.0～6.0，在可溶性蛋白濃度逐漸降低的過程中，相對分子質量>66.2 kDa的亞基先完全消失，隨后是相對分子質量為22.0～43.0 kDa的亞基，最后是相對分子質量為43.0～66.2 kDa的亞基。pH為2.0，3.0時，酸性條件造成了肽鏈的部分水解，形成了相對分子質量為31.0～43.0 kDa的亞基條帶，其中pH 2.0時形成的亞基相對分子質量較pH 3.0時大，被還原后形成了14.4～22.0 kDa 的小分子多肽。

由圖8可知，不同離子強度對可溶性燕麥分離蛋白的亞基條帶影響顯著，對比圖7中pH 7.0時亞基條帶可知，由于鹽離子的加入，造成了可溶性燕麥分離蛋白肽鏈的斷裂(可能是二硫鍵的斷裂)，形成了相對分子質量分別為43.0，66.2 kDa的多肽鏈，且被還原后未發生變化，說明斷裂后的多肽鏈不含二硫鍵。當NaCl濃度為0.05 mol/L 時，可溶性蛋白主要由相對分子質量為43.0 kDa 的亞基組成，隨著鹽離子濃度的增加，相對分子質量為66.2 kDa多肽先溶解，隨后相對分子質量為43.0～66.2 kDa的亞基(酸性多肽與堿性多肽通過二硫鍵連接形成)溶解。

M. 低分子量蛋白Marker 1～12. 依次為pH 2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0

圖7 不同pH條件下燕麥分離蛋白SDS-PAGE圖

Figure 7 SDS-PAGE analysis of oat protein isolate under different pH conditions

M. 低分子量蛋白Marker 1～12. 依次為NaCl濃度0.01，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 mol/L

圖8 不同離子強度下燕麥分離蛋白SDS-PAGE圖

Figure 8 SDS-PAGE analysis of oat protein isolate under different ionic strength conditions

3 結論

燕麥分離蛋白在pH 5.0～6.0時溶解度最低，起泡性最低，泡沫穩定性最高，在堿性條件下乳化性及乳化穩定性較高；pH 2.0，3.0的酸性條件造成了可溶性燕麥分離蛋白肽鏈的部分水解，形成了相對分子質量為31.0～43.0 kDa 的亞基條帶，堿性條件下無明顯區別。NaCl濃度為0.05 mol/L時溶解度最低，NaCl濃度為0.6～0.9 mol/L 時，起泡性、泡沫穩定性及乳化性均較高；溶解度最低時，可溶性蛋白主要是由相對分子質量為43.0 kDa 的亞基組成，NaCl的加入造成了可溶性燕麥分離蛋白肽鏈的斷裂，形成了相對分子質量分別為43.0，66.2 kDa的多肽鏈。試驗僅研究了pH及離子強度對燕麥分離蛋白的功能特性與亞基特性的影響，后續可采用現代高新技術分析其他相關性質指標。