猴頭菇多糖和蛋白質(zhì)閃式聯(lián)合提取工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)鑒定

張 雄 肖志勇 黃 群黃 翔 楊 燃 陳 雷 王藝偉

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建拓天生物科技有限公司，福建 福州 350001)

猴頭菇屬菌物界擔(dān)子菌門猴菇目[1]，富含多糖、蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸[2]。猴頭菇多糖對胃黏膜有保護(hù)作用，可促進(jìn)消化，還具有提高免疫力、抗衰老、降血糖等效果[3]。猴頭菇多糖常用的提取方法有熱水提取[4]、酸堿提取[5]、酶提取[6]和微波輔助提取[7]等。但熱水法和微波輔助法提取猴頭菇多糖時(shí)溫度高，對熱敏性成分破壞大，而酸堿法和酶法提取時(shí)對多糖中活性成分破壞大。閃式提取技術(shù)利用高速的機(jī)械剪切力和攪拌力，迅速有效地破壞植物細(xì)胞組織，通過局部負(fù)壓滲透作用使有效成分迅速擴(kuò)散至溶劑中[8]，具有提取速度快、溫度低等優(yōu)點(diǎn)，能有效保留熱敏性成分與活性[9]。目前閃式提取技術(shù)在金針菇[10]、白鮮皮[11]和黃芪[12]等多糖提取方面已有應(yīng)用，但未見用于猴頭菇多糖提取的相關(guān)報(bào)道。

試驗(yàn)擬采用閃式提取法同步提取猴頭菇中多糖和蛋白質(zhì)，并對多糖結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)亞基組成進(jìn)行分析，以期為猴頭菇多糖和蛋白質(zhì)的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇子實(shí)體：湖北裕國菇業(yè)股份有限公司；

無水葡萄糖、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)：北京索萊寶科技有限公司；

濃硫酸、磷酸、苯酚、三氯乙酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

閃式提取器：JHBE-50T型，河南智晶生物科技股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYEL4型，上海愛朗儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：EYEL4型，上海愛朗儀器有限公司；

高速中藥粉碎機(jī)：150B搖擺式，浙江溫州瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1780型，島津儀器蘇州有限公司；

傅立葉紅外光譜儀：AVATAR360型，美國尼高力儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

猴頭菇子實(shí)體→干燥(40 ℃，16 h)→粉碎→加蒸餾水閃式提取→離心(5 000 r/min，10 min)→調(diào)整提取液pH值至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pH 3.65)→離心(8 000 r/min，10 min)→得上清液(粗多糖溶液)和沉淀(蛋白質(zhì))

1.3.2 猴頭菇粗多糖純化 取猴頭菇粗多糖提取液，加入溶液體積1/3的 D315大孔樹脂脫色，磁力攪拌4 h，過濾后取濾液。濾液移至2 500 Da透析袋中透析，4 ℃蒸餾水中透析48 h，每4～5 h換水一次。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后置于冷凍干燥冷阱中預(yù)凍12 h，再經(jīng)冷凍干燥(-40 ℃，16 Pa)得到HEP粉末[13]。

1.3.3 工藝條件優(yōu)化 試驗(yàn)以猴頭菇多糖提取為主、蛋白質(zhì)提取為輔，單因素主要考慮多糖得率的影響，蛋白質(zhì)未尋找到最優(yōu)的提取條件，所以響應(yīng)面試驗(yàn)僅以多糖得率為評價(jià)指標(biāo)優(yōu)化提取工藝。

(1) 提取時(shí)間的影響：粉體粒度80目，按液料比18∶1 (mL/g)加入蒸餾水，電壓100 V，提取時(shí)間分別設(shè)置為20，40，60，80，100，120 s，考察提取時(shí)間對多糖與蛋白質(zhì)得率的影響。

(2) 料液比的影響：粉體粒度80 目，液料比分別設(shè)置為14∶1，16∶1，18∶1，20∶1，22∶1 (mL/g)，提取電壓100 V，提取時(shí)間60 s，考察料液比對多糖與蛋白質(zhì)得率的影響。

(3) 粉體粒度的影響：猴頭菇干粉分別按40，60，80，100，120目過篩，按液料比18∶1 (mL/g)加入蒸餾水，電壓100 V，提取時(shí)間60 s，考察粉體粒度對多糖與蛋白質(zhì)得率的影響。

(4) 提取電壓的影響：粉體粒度80 目，液料比18∶1(mL/g)，提取時(shí)間60 s，提取電壓設(shè)置100，125，150，175，200 V，考察提取電壓對多糖與蛋白質(zhì)得率的影響。

(5) 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化：根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取對提取得率影響較大的因素進(jìn)行中心組合試驗(yàn)。

1.3.4 多糖得率的測定

(1) 多糖含量的測定：采用苯酚—硫酸法[14]，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，溶液在 490 nm 處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程見式得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.009 8X+0.029 3，R2=0.992 6。

(2) 多糖得率計(jì)算：將提取液稀釋至合適倍數(shù)后測量其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度，按式(1)計(jì)算多糖得率。

(1)

式中：

Y——猴頭菇多糖得率，%；

y——多糖濃度，mg/mL；

b——測定多糖時(shí)稀釋倍數(shù)；

V——提取液的總體積，mL；

m——猴頭菇粉末質(zhì)量，g。

1.3.5 蛋白質(zhì)得率的測定

(1) 蛋白質(zhì)含量的測定：采用考馬斯亮藍(lán)法[15]，用紫外分光光度計(jì), 以試劑空白做參比, 在 595 nm波長處測定對照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo), 蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo), 得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.003 4X-0.026 3，R2=0.991 7。

(2) 蛋白質(zhì)得率計(jì)算：將提取液稀釋至合適倍數(shù)后測量其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，按式(2)計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

(2)

式中：

X——猴頭菇蛋白質(zhì)得率，%；

x——蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；

c——測定蛋白質(zhì)時(shí)稀釋倍數(shù)；

V——提取液的總體積，mL；

m——猴頭菇粉末質(zhì)量，g。

1.3.6 產(chǎn)物鑒定

(1) 多糖：取3 mg HEP粉末與0.3 g KBr研磨混合均勻，壓制薄片，進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，掃描波長為4 000～400 cm-1。

(2) 蛋白質(zhì)：采用蒸餾水復(fù)溶猴頭菇蛋白質(zhì)(蒸餾水30 mL)得到渾濁液，再經(jīng)離心分離(8 000 r/min，10 min)得到上清液，參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各檢驗(yàn)指標(biāo)分別測定3次，取平均值，采用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行顯著性分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對多糖和蛋白質(zhì)得率的影響 由圖1可知，提取時(shí)間為20～60 s時(shí)，猴頭菇多糖和蛋白質(zhì)得率均增加。提取時(shí)間超過60 s后，猴頭菇多糖得率下降，可能是由于時(shí)間較長，閃式提取刀頭積攢的能量較多而發(fā)熱，引起多糖分解，導(dǎo)致得率降低；蛋白質(zhì)得率變化不大，可能是提取60 s后閃式提取達(dá)到平衡。故提取時(shí)間控制在60 s左右為宜。

2.1.2 液料比對多糖和蛋白質(zhì)得率的影響 由圖2可知，猴頭菇多糖得率隨著液料比的增加先增加后減少，而蛋白質(zhì)得率變化趨勢相反。多糖得率在液料比18∶1 (mL/g)之后降低，可能是由于液料比過高，會降低猴頭菇與閃式剪切刀頭接觸的機(jī)會，同時(shí)過高的液料比會增加后續(xù)濃縮的難度。故液料比取18∶1(mL/g)較佳。

同一曲線字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effect of time on extraction yield rate of polysaccharide and protein fromHericiumerinaceu

同一曲線字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield rate of polysaccharide and protein fromHericiumerinaceu

2.1.3 粉體粒度對多糖和蛋白質(zhì)得率的影響 由圖3可知，隨著粉體粒度的減小，多糖得率先增加后減小，可能是物料粒徑過小時(shí)，其表面能較大且微粒間相互黏連，不利于多糖的溶出，導(dǎo)致得率降低；粉體粒度越小，蛋白質(zhì)得率越低，可能是蛋白質(zhì)與脂肪的乳化作用所致，100目后乳化作用達(dá)到平衡，得率不再顯著降低。故粉體粒度取100目左右為宜。

2.1.4 提取電壓對多糖和蛋白質(zhì)得率的影響 由圖4可知，隨著閃式提取電壓的增加，猴頭菇多糖得率逐漸增加，蛋白質(zhì)得率先降低后上升。由于試驗(yàn)所用閃提器電壓參數(shù)控制范圍為100～200 V，而且試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，提取電壓超過125 V后由于刀頭轉(zhuǎn)速越快，通過機(jī)械能轉(zhuǎn)化而來的熱能較多，導(dǎo)致體系溫度明顯升高，可能會導(dǎo)致提取的多糖與蛋白質(zhì)變性，甚至失去活性。因此將提取電壓固定為100 V。

同一曲線字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Effect of grinding granularity on extraction yield rate of polysaccharide and protein fromHericiumerinaceu

同一曲線字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Effect of voltage on extraction yield rate of polysaccharide and protein fromHericiumerinaceu

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，固定提取電壓為100 V，選取對提取得率影響較大的提取時(shí)間、液料比、粉體粒度進(jìn)行中心組合試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼及水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

利用Design Expert 8.06軟件將響應(yīng)值(多糖得率)和各個因素進(jìn)行多元回歸擬合，得出試驗(yàn)因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及多次效應(yīng)的響應(yīng)面回歸模擬方程：

Y=9.18+0.21A-0.08B-0.26C+0.017AB+0.025AC-0.042BC-0.19A2-0.18B2-0.33C2。

(3)

表1 三因素水平設(shè)計(jì)表

2.2.3 模型的優(yōu)化分析及驗(yàn)證 由Design Expert 8.06軟件得出模型預(yù)測閃式提取猴頭菇多糖的最佳條件為提取時(shí)間69.28 s、液料比17.26∶1(mL/g)、粉體粒度92.83目，此條件下猴頭菇多糖得率為9.28%。考慮到實(shí)際操作對上述模型預(yù)測最優(yōu)條件進(jìn)行修正，最終多糖優(yōu)化條件為：提取時(shí)間70 s、液料比17∶1 (mL/g)、粉體粒度90目，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，猴頭菇中多糖得率為(9.24±0.15)%，與理論預(yù)測值9.28%極為接近，說明用該模型對猴頭菇多糖的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化具有一定的實(shí)際可操作性。該條件下蛋白質(zhì)提取率為1.33%。

表2響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table2Experimentaldesignandresultsofresponsesurfaceanalysis

試驗(yàn)號ABCY多糖得率/%11108.972-10-18.7131018.6640009.20510-19.096-1018.1870009.1980009.1790118.25101-109.051101-18.8912-1-108.68130-1-19.01140009.15150-118.5416-1108.53170009.17

表3 多糖得率回歸模型方差分析表

2.3 產(chǎn)物鑒定

2.3.1 多糖 閃式提取的猴頭菇多糖的紅外光譜見圖5。猴頭菇多糖在3 400 cm-1附近有比較寬的強(qiáng)吸收峰，2 930 cm-1附近有弱吸收峰，1 400～1 200 cm-1的弱吸收峰都屬于多糖的特征吸收峰[17]。3 400 cm-1較寬的峰是羥基O—H的伸縮振動引起，2 925 cm-1處較弱的吸收峰是甲基C—H的伸縮振動引起[18]；1 401 cm-1處的峰是C—H與C—O的共同伸縮振動引起[19]；1 151 cm-1處的峰是C—OH的側(cè)鏈伸縮振動引起；1 078 cm-1和1 038 cm-1的峰是糖苷鍵C—O—C的伸縮振動引起，918 cm-1處的吸收峰是由于D-吡喃環(huán)的不對稱伸縮振動產(chǎn)生[20]。

圖5 HEP的紅外光譜

李珊珊等[21]研究表明，猴頭菇由葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和甘露糖組成。試驗(yàn)所得猴頭菇多糖經(jīng)水解和衍生化處理后進(jìn)行氣相色譜分析，除了常見的葡萄糖、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖7種單糖外，還有具有潛在研究價(jià)值的未知峰，證明了閃式提取法能有效保護(hù)天然產(chǎn)物的活性成分。

2.3.2 蛋白質(zhì) 由圖6可知，在66.4 kDa和44.3 kDa附近各有一條明顯帶。從Unipot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)可知，猴頭菇蛋白質(zhì)分子量在66.4 kDa左右主要是色素，而44.3 kDa左右主要是微管蛋白和核糖核酸酶。Lee等[22]對猴頭菇粗蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)少量真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的相對分子質(zhì)量為10～14 kDa，Humans等[23]研究發(fā)現(xiàn)，提取的猴頭菇蛋白中相對分子質(zhì)量低于14.3 kDa的酸性蛋白主要參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑；猴頭菇中相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)參與了猴頭菇物多種代謝途徑。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，閃式同步提取猴頭菇多糖和蛋白質(zhì)最佳提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間80 s、液料比17∶1 (mL/g)、粉體粒度80目、提取電壓100 V，該條件猴頭菇多糖得率為(9.24±0.15)%，蛋白質(zhì)得率為1.34%。采用傅里葉紅外光譜法對猴頭菇多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)在3 400 cm-1附近有比較寬的強(qiáng)吸收峰，2 930 cm-1和1 400～1 200 cm-1附近有弱吸收峰，均屬于多糖的特征吸收峰；單糖組成以葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和甘露糖含量較多。猴頭菇蛋白質(zhì)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)在66.4 kDa和44.3 kDa附近各有一條明顯帶，主要是微管蛋白和核糖核酸酶。閃式提取法能有效保護(hù)猴頭菇多糖與蛋白質(zhì)的天然活性成分。

M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 1. 閃式提取的猴頭菇蛋白質(zhì)