3種還原糖對蕓豆清蛋白糖基化改性產物乳化性及結構的影響

林 巍 劉曉蘭 任 健 高 健 杜 宏

(1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蕓豆是黑龍江種植面積最大的豆類作物之一，營養豐富，其中清蛋白含量較高，并且所含氨基酸種類豐富，配比合理。但是由于蕓豆蛋白的理化性質限制了其應用，目前蕓豆蛋白在食品行業的利用率還比較低，深加工產品綜合利用技術水平低且附加值不高。近年來，眾多學者致力于蕓豆蛋白功能特性的改善研究，如：劉高梅等[1]研究表明超聲能夠改善蕓豆蛋白的部分理化性質和功能性質；左鋒等[2]采用乙?；幚韺κ|豆分離蛋白進行了改性，發現乙?；男院笫|豆分離蛋白的表面巰基含量和表面疏水性顯著提高，并且增強了凝膠形成過程中蛋白質分子相互作用；何慶燕等[3]研究了雞肉蛋白與蕓豆蛋白交聯對蛋白質凝膠性、乳化性等功能性質的影響，發現TG酶促交聯能促進雞肉蛋白和蕓豆蛋白交聯，并有利于改善混合蛋白食品的功能特性。蛋白質的美拉德反應是蛋白自由氨基與還原糖羰基之間發生的非酶褐變反應，廣泛存在于食品加工和貯藏過程中，此反應能夠有效改善蛋白的功能性質[4-5]。但是目前關于蕓豆蛋白糖基化改性的相關研究甚少，僅有馮玉超等[6]使用氨基葡萄糖對蕓豆蛋白進行了糖基化改性，發現糖基化后蕓豆蛋白的溶解性、乳化性、起泡性皆有所提高，表明利用糖基化改善蕓豆蛋白功能性具有可行性。不同的還原糖美拉德反應效果有所不同，因此研究并篩選美拉德反應最佳的還原糖，可最大程度提高蕓豆蛋白的功能性。試驗擬探討3種還原糖與蕓豆清蛋白美拉德反應產物的乳化性與結構之間的構效關系，以期改善蕓豆蛋白的功能特性，為開發穩定的蕓豆蛋白高附加值產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

紫花蕓豆：蛋白含量23.77%，市售；

5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：分析純，美國Sigma公司；

葡萄糖、果糖、乳糖：分析純，天津凱通化學試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設備

多功能酶標儀：EnSpire型，美國珀金埃爾默公司；

電子分析天平：FA1004型，上海巴拓儀器有限公司；

高速離心機：CF15RXII型，日本日立公司；

真空冷凍干燥機：Alphal-4/1sc型，德國Martin Christ公司；

水浴恒溫振蕩器：SHZ-88型，常州潤華電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫花蕓豆清蛋白(KPI)的提取 根據文獻[7]對紫花蕓豆中清蛋白進行提取，提取物-80 ℃冷凍干燥48 h后，-20 ℃保存備用。

1.2.2 蕓豆蛋白美拉德反應產物的制備 將提取的蕓豆蛋白配制成30 mg/mL的溶液3份，分別加入葡萄糖、果糖和乳糖，使糖與蛋白質量比為1∶1，攪拌均勻后，調pH值至8.0后，90 ℃水浴中反應180 min，反應后迅速冷卻，得到蕓豆蛋白(KPI)—各還原糖美拉德反應產物(KPI與乳糖產物簡稱為KPI+L、KPI與葡萄糖產物簡稱為KPI+G、KPI與果糖產物簡稱為KPI+F)，各產物-80 ℃冷凍干燥48 h后，-20 ℃保存備用。

1.2.3 乳化性測定 根據文獻[8]。

1.2.4 表面疏水性 根據文獻[9]，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為0.025，0.100，0.250，0.500，1.000 mg/mL 的蕓豆蛋白溶液，設定激發波長374 nm，發射波長467 nm，測定蕓豆蛋白的熒光強度，以熒光強度對蕓豆蛋白濃度作圖，曲線的初始斜率即樣品的表面疏水值H0。

1.2.5 巰基含量測定 用pH 8.0的Tris-甘氨酸緩沖液將蕓豆蛋白稀釋為2 mg/mL的蛋白樣品，根據文獻[9]測定蕓豆蛋白表面巰基含量和游離巰基含量。

1.2.6 紫外吸收光譜分析 根據文獻[10]，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液作為空白對照，并用其將樣品稀釋至蛋白質量濃度為1 mg/mL，紫外掃描光譜范圍230～400 nm。

1.2.7 內源熒光光譜分析 根據文獻[10]，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液將樣品稀釋至蛋白質量濃度為1 mg/mL。在激發波長280 nm條件下，發射光譜范圍300～480 nm內進行掃描，激發和發射狹縫寬度均為5 nm。

1.3 數據處理

應用SPSS 19.0軟件，對數據進行單因素方差分析，差異顯著者再進行LSD檢驗。各組數據結果以(平均數±標準差)表示。

2 結果與分析

2.1 對蕓豆清蛋白美拉德產物乳化性及乳化穩定性的影響

如圖1所示，3種還原糖與KPI的美拉德反應產物的EAI及ESI均極顯著高于KPI的(P<0.01)；其中KPI+F的乳化性及乳化穩定性最理想，乳化性由原來的37.52 m2/g 增加為98.69 m2/g，乳化穩定性由16.88 min增加到28.68 min。美拉德反應過程中糖的引入，使KPI空間結構發生改變，處于蛋白質內部的疏水性基團暴露出來，在油—水界面發生變性，可使蛋白具有雙親表面活性劑的功能，增強了對蛋白表面的保護，阻止油滴的聚集，使乳化活性增強[11]。

*. 與KPI組相比差異顯著(P<0.05) **. 與KPI組相比差異極顯著(P<0.01)

圖1 糖對蕓豆清蛋白美拉德產物乳化性和乳化穩定性的影響

Figure 1 Effects of sugars on ESI of maillard products of kidney bean protein

2.2 對蕓豆清蛋白美拉德產物表面疏水性的影響

表面疏水性(H0)用來表征蛋白質在極性環境中表面疏水性氨基酸殘基的數量，可反映蛋白質構象變化[12]。由圖2可知，與蕓豆蛋白的表面疏水性相比，3種還原糖與蕓豆蛋白美拉德反應產物的表面疏水性均顯著增強(P<0.01)。這可能是KPI與還原糖發生接枝反應，導致KPI空間結構發生改變，使蛋白質分子內氫鍵、靜電、疏水相互作用發生變化，暴露了蛋白質分子內部的疏水性基團，掩蓋周圍的親水性基團，增加了蛋白的表面疏水性，蛋白質的功能性質也隨之改變。

*. 與KPI組相比差異顯著(P<0.05) **. 與KPI組相比差異極顯著(P<0.01)

圖2 蕓豆清蛋白及其美拉德產物的表面疏水性

Figure 2 The surface hydrophobicity of kidney bean protein and its maillard products

2.3 對蕓豆清蛋白美拉德產物巰基含量的影響

巰基是蛋白質中重要的官能團，參與弱次級鍵的形成，維持三級結構穩定，其含量變化反映了蛋白的變性程度，對蛋白質功能性質有關鍵的影響，表面巰基含量變化還可反映出蛋白高級結構的變化[9]。由圖3可知，還原糖的接入，使KPI表面巰基和總游離巰基含量均顯著降低(P<0.01)，可能是美拉德反應使蛋白質形成高分子多聚體，在這個過程中表面巰基可轉化為二硫鍵，導致蕓豆蛋白美拉德反應產物表面巰基含量的下降；而總游離巰基含量的顯著降低也進一步證明了蕓豆蛋白在與還原糖發生美拉德反應后，分子結構中的游離巰基發生反應形成二硫鍵，參與蛋白空間結構的改變，使蛋白的功能性質改變。

2.4 對蕓豆清蛋白美拉德產物紫外吸收光譜的影響

蛋白質產生紫外吸收光譜主要是因為色氨酸和酪氨酸在280 nm波長附近有一個吸收峰。由圖4可知，蕓豆清蛋白及其與3種還原糖的美拉德產物在284 nm處有最大吸收峰，其中KPI、KPI+L及KPI+G紫外吸收波譜基本一致，未見明顯變化；僅蕓豆蛋白與果糖的美拉德反應產物KPI+F的紫外吸光度明顯增加，可能是KPI+F在溶液中的構象發生改變，蛋白分子外部生色基團暴露出來，引起紫外吸光度升高。此結果與之前測得的蛋白乳化性及其穩定性的變化相一致，表明不同還原糖對美拉德反應的影響不同，其中蕓豆—果糖美拉德產物的結構變化最大，功能性質改變最明顯。

*. 與KPI組相比差異顯著(P<0.05) **. 與KPI組相比差異極顯著(P<0.01)

圖3 蕓豆清蛋白及其美拉德產物的巰基含量

Figure 3 The sulfhydry content of kidney bean protein and its maillard products

圖4 蕓豆清蛋白及其美拉德產物的紫外吸收光譜

2.5 對蕓豆清蛋白美拉德產物內源熒光光譜的影響

蛋白質內源熒光光譜主要是由其分子中的色氨酸殘基側鏈發射產生的。色氨酸對局部環境的變化具有高靈敏性，通過蛋白分子中側鏈的色氨酸殘基變化可以反映美拉德反應過程中蛋白三級結構的變化[13]。由圖5可知，3種還原糖的美拉德產物的內部熒光強度均低于KPI，降低程度為KPI+F>KPI+L>KPI+G，表明KPI與3種還原糖發生美拉德反應，改變了蛋白質的三級結構，降低了KPI的熒光強度。最大吸收波長(λmax)與色氨酸殘基所處微環境有關，λmax>330 nm表明色氨酸殘基暴露于蛋白質分子外部的極性環境中，λmax<330 nm表示色氨酸殘基包埋于蛋白質分子內部的非極性環境中，λmax越大色氨酸殘基的微環境極性越強[14]。由圖5還可知，KPI+L的λmax由345 nm(KPI的λmax)變為350 nm，而KPI+F和KPI+G的λmax變為355 nm，即發生紅移，說明KPI因與糖發生共價交聯，而使色氨酸殘基暴露于更加親水的環境中。3種還原糖中，果糖反應物的熒光強度最低，發射波長最長，此結果與之前測得的蛋白乳化性增強及紫外吸收光譜的改變等結果相一致，進一步證明了果糖的反應活性最大，美拉德反應最強烈，用于蕓豆蛋白美拉德糖基化改性的效果最好。

圖5 蕓豆清蛋白及其美拉德產物的內源熒光光譜

Figure 5 Changes of intrinsic fluorescence spectra of kidney bean protein and its maillard products

3 結論

試驗采用美拉德反應對蕓豆清蛋白進行改性，制備了蕓豆蛋白和葡萄糖、果糖及乳糖美拉德反應產物，通過對蛋白表面疏水性、巰基含量、內部熒光光譜和紫外吸收光譜分析得出，蕓豆蛋白與還原糖發生美拉德反應后，空間結構發生變化，蛋白分子內部生色基團、疏水性基團暴露，色氨酸微環境改變，導致紫外吸收增加，內部熒光強度降低且發生紅移，使蕓豆蛋白表面疏水性增強，更有利于蛋白吸附到油水界面，使乳化性增強。葡萄糖、果糖和乳糖與蕓豆蛋白發生美拉德反應程度略有不同，從改善蕓豆蛋白的乳化活性及乳化穩定性角度看，其中果糖改善效果最好。后續可對蕓豆蛋白美拉德反應產物在具體食品模型中的應用進行研究，以利于蕓豆資源的合理開發和用。