納豆芽孢桿菌發酵黑豆豆豉的前發酵工藝優化

張 琪 朱 丹 牛廣財 魏文毅 趙 婧 武 悅

(1. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319； 2. 黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

黑豆為豆科植物大豆的黑色種子，又稱烏豆、黑大豆，在東北地區產量最大。黑豆營養豐富，因含植物固醇、黃酮、皂苷等成分，具有較好的降血脂、降膽固醇、抗氧化等功能[1-3]，是開發抗氧化、抗衰老食品的優質藥食兼用資源。

豆豉是一種以大豆為主要原料，經過制曲、微生物發酵階段和后熟而形成的傳統發酵食品[4]，具有藥食兩用性。目前，豆豉的制作原料以黃豆為主，發酵采用的菌種較多，所得產品的抗氧化性也各不相同。例如，侯竹美等[5]通過米曲霉發酵黃豆，發現黃豆豉在發酵24 d時還原能力和總酚含量達到最高值，總酚含量為0.024 mg/mL；發酵27 d時黃豆豉對羥自由基和DPPH自由基的清除率達到最大，分別達到了36.07%和64.86%。吳蘭芳等[6]研究了霉菌型黑豆豆豉的主要成分及其抗氧化活性，結果顯示：黑豆經過選用米曲霉(AspergillusoryzaeRIB40)、米根霉(Rhizopusoryzaestrain FSU 6156)發酵后，抗氧化活性增強。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是發酵細菌型豆豉的最主要的菌株，而納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto，BSN)是枯草芽孢桿菌的一個亞種，其對環境具有較高的耐受性和穩定性[7]，是制作發酵食品常用的一種有益菌[8]。例如，徐春明等[9]研究了納豆芽孢桿菌發酵大豆(黃豆)的不同發酵階段，納豆總酚和異黃酮含量的變化規律以及體外模擬消化過程中總酚、異黃酮含量與抗氧化活性的變化，結果表明：總酚含量提高了65.12%，然而異黃酮含量卻降低了63.30%，在模擬胃消化階段，后熟24 h大豆清除ABTS自由基能力和ORAC值分別是干燥大豆的1.80，2.22倍；模擬腸消化階段，后熟24 h大豆清除ABTS自由基能力和ORAC值分別是干燥大豆的1.70，1.41倍，經過發酵的納豆抗氧化活性加強。

試驗擬以黑豆為原料，采用納豆芽孢桿菌為菌種，發酵制備黑豆豆豉，以總多酚含量和DPPH·清除率為指標，采用正交試驗來確定其最佳的前發酵工藝條件，以期為黑豆豆豉工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 原料和試劑

黑豆：黑龍江省農墾九三榮軍農場；

納豆芽孢桿菌粉：上海賀普實業有限公司；

福林酚試劑：上海藍季科技發展有限公司；

沒食子酸、氫氧化鈉、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、抗壞血酸、鐵氰化鉀、碳酸鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼基自由基(DPPH)：分析純，梯希愛化成工業發展有限公司。

1.1.2 儀器與設備

電子天平：EX324型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

隔水式恒溫培養箱：GHP-9160型，上海市一恒科學儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DGG-9053A型，上海森信實驗儀器有限公司；

低速離心機：L420型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

紫外—可見分光光度計：L5型，上海儀電分析儀器有限責任公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-75KB型，上海中安醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

黑豆→浸泡→高溫高壓蒸豆→冷卻→接菌→發酵→取樣→測定

1.2.2 操作要點

(1) 室溫下，黑豆與蒸餾水的比例為1∶5 (g/mL)，浸泡24 h后取出瀝干，然后在121 ℃的高溫高壓蒸汽滅菌鍋中蒸豆處理17 min。

(2) 蒸豆后在室溫下冷卻30 min，接入不同比例的納豆芽孢桿菌粉(均勻撒在黑豆樣品表面)。

(3) 在溫度為35～39 ℃的恒溫箱中培養1～4 d，進行前發酵，并按發酵時間進行取樣，測定相關指標。

1.2.3 單因素試驗設計

(1) 發酵時間對黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響：將高溫高壓處理的黑豆冷卻后，接入1.5 g/100 g·黑豆納豆芽孢桿菌，置于39 ℃恒溫箱中培養發酵，發酵時間分別為1，2，3，4 d，測定所得黑豆豆豉的總多酚含量和DPPH·清除率。

(2) 發酵溫度對黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響：將高溫高壓處理的黑豆冷卻后，接入1.5 g/100 g·黑豆納豆芽孢桿菌分別置于35，37，39，41，43 ℃的恒溫箱中培養發酵3 d，測定所得黑豆豆豉的總多酚含量和DPPH·清除率。

(3) 納豆芽孢桿菌接種量對黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響：將高溫高壓處理的黑豆冷卻后，接入納豆芽孢桿菌，其接種量分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/100 g·黑豆，后置于41 ℃恒溫箱中培養發酵3 d，測定所得黑豆豆豉的總多酚含量和DPPH·清除率。

1.2.4 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，以發酵時間、發酵溫度、接種量為試驗因素，以總多酚含量和DPPH清除率為評價指標，設計L9(33)正交試驗優化納豆芽孢桿菌發酵黑豆豆豉工藝條件。

1.2.5 總多酚測定 采用Folin-Ciocalteu比色法。標準曲線的繪制根據文獻[10]，修改如下：準確稱取沒食子酸0.100 0 g，用容量瓶定容至100 mL，得到沒食子酸標準液濃度為1 000 mg/L。分別配制濃度為0.0，12.5，25.0，50.0，100.0 mg/L的標準溶液。得到沒食子酸標準曲線(見圖1)方程為：y= 0.018x+0.078 4，R2=0.998 5。

取2 g黑豆樣品加以研磨后加蒸餾水定容至20 mL。3 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，將其稀釋50倍；

圖1 沒食子酸標準曲線

分別加入福林酚顯色劑1 mL，20% Na2CO3溶液3 mL，混勻，在50 ℃水浴反應30 min后測定吸光度。按式(1)計算總多酚含量[11]。

(1)

式中：

R——總多酚含量，mg/g；

C——樣液總酚濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數；

W——黑豆質量，g。

1.2.6 DPPH自由基(DPPH·)清除率的測定 根據文獻[12]，修改如下：稱取19.7 mg DPPH，用95%乙醇溶解并定容至100 mL(DPPH濃度為0.5 mmol/mL)，配制好后0～4 ℃下避光保存。取2 mL稀釋后的樣液與0.5 mL DPPH溶液，混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用95%甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度；取2 mL 95%甲醇與0.5 mL DPPH溶液混合，混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度；取2 mL處理好的樣液與0.5 mL 95%甲醇混合，混合均勻后37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用95%甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度。按式(2)計算DPPH·清除率。

(2)

式中：

Y——DPPH·清除率，%；

Ai——加發酵液反應后DPPH溶液的吸光度；

Ac——加DPPH溶液，不加發酵液的吸光度；

Aj——加發酵液，不加DPPH溶液的吸光度。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0軟件對試驗所得數據進行統計計算，并采用Origin 9.0軟件進行作圖分析。所有試驗均進行3次平行。

2 結果與分析

2.1 發酵時間對黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

由圖2可知，在前3 d，隨著發酵時間的延長，總多酚含量和DPPH·清除率均升高，說明發酵初期對納豆芽孢桿菌的代謝活動有很大影響；當發酵時間到第3天時，總多酚含量和DPPH·清除率達到最高值，分別為3.67 mg/g和84.9%，可能是納豆芽孢桿菌將復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質，使得總多酚含量升高；此外，隨著發酵時間的不斷增加，自身的抗氧化物質不斷浸出，而酚類物質能給出一個氫離子并通過共振雜化而穩定[13]，且含有的多酚類化合物具有較強的自由基清除能力[14]。發酵到第4天時，多酚含量相對較低，但是，此時DPPH·清除率仍然較高，說明黑豆豆豉中除了多酚物質外，還含有其他具有較高DPPH·清除率的活性物質，如黃酮類物質、原花青素物質等。因此，發酵時間選擇2，3，4 d 進行正交試驗。

圖2 發酵時間對黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

Figure 2 Effect of different fermentation time on total polyphenol content and DPPH radical scavenging rate of fermented black bean

2.2 發酵溫度對黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

由圖3可知，在41 ℃之前，隨著發酵溫度的升高，總多酚含量也持續升高，當溫度在41 ℃時，總多酚含量達到最高，為3.99 mg/g，可能是在發酵過程中，分子的滲透、擴散、溶解速率會隨著溫度升高而加快[15]，然而高溫可在一定程度上破壞細胞壁的完整性[16]。當溫度為39 ℃ 時，DPPH·清除率達到最高。可以初步判斷當發酵時間在39～41 ℃時總多酚含量高，抗氧化能力強，DPPH·清除率高。由于納豆芽孢桿菌的發酵溫度一般在38～45 ℃，所以，在后續正交試驗中，發酵溫度選擇39，41，43 ℃ 3個水平。

圖3 發酵溫度對黑豆豆豉總多酚含量和

Figure 3 Effect of different fermentation temperature on total polyphenols content and DPPH radical scavenging rate of fermented black bean

2.3 接種量對黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

由圖4可知，隨著接種量的增加，總多酚含量及DPPH·清除率均呈先升高再降低的趨勢，當接種量為2.0 g/100 g·黑豆時，總多酚含量及DPPH·清除率均達到最高值，可能是菌種在發酵的過程中產酸，使pH降低，從而在一定程度上影響酶的活性，微生物的細胞膜所帶電荷會有所改變，因此改變了細胞膜的透性，從而降低了菌種對營養物質的吸收和代謝物的排泄[17]。因此，在后續正交試驗中接種量選擇1.5，2.0，2.5 g/100 g·黑豆3個水平。

圖4 接種量對黑豆豆豉總多酚含量和

Figure 4 Effect of different inoculation amount on total polyphenol content and DPPH radical scavenging rate of fermented black bean

2.4 正交試驗

以發酵時間、發酵溫度、接種量為試驗因素，按照表1進行正交試驗，以確定最佳發酵條件，結果見表2。由表2可知，對總多酚含量和DPPH·清除率兩個指標的主次影響順序均為A>C>B。由發酵產物的總多酚含量的正交試驗結果可知，發酵的最佳條件是A3B2C2；由發酵產物的DPPH·清除率的正交試驗結果可知，發酵的最佳條件是A3B1C3。由表3、4可知，各因素對總多酚含量和DPPH·清除率的影響均不顯著(P<0.05)。

綜合考慮上述兩個正交試驗結果的差異，進行驗證實驗，如表5所示，最佳的發酵條件為A3B1C3，即發酵時間4 d、發酵溫度39 ℃、接種量2.5 g/100 g·黑豆，該條件發酵所得黑豆豆豉的總多酚含量可達到4.24 mg/g，DPPH·清除率達到79.86%。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果分析

表3以總多酚含量為評價指標的正交試驗結果方差分析

Table3Varianceanalysisoforthogonalexperimentsusingtotalpolyphenolcontentasevaluationindex

來源平方和自由度方差F值顯著性A3.91721.9593.8940.204B0.01520.0080.0150.985C0.23320.1170.2320.812誤差1.00620.503校正總計5.1728

表4以DPPH·清除率為評價指標的正交試驗結果方差分析

Table4VarianceanalysisoforthogonalexperimentsusingDPPHscavengingrateasevaluationindex

來源平方和自由度方差F值顯著性A579.1792289.59014.1440.066B52.677226.3381.2860.437C264.3702132.1856.4560.134誤差40.947220.474校正總計937.1748

表5 驗證實驗

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗得出，黑豆豆豉前發酵的最優工藝組合為發酵時間4 d，發酵溫度39 ℃，接種量2.5 g/100 g·黑豆，該條件發酵所得黑豆豆豉的總多酚含量為4.24 mg/g，DPPH·清除率為79.86%。研究結果表明，采用納豆芽孢桿菌發酵來生產抗氧化能力較強的黑豆豆豉是可行的。后續將對后發酵中發酵時間、發酵溫度以及食鹽、白酒等輔料對黑豆豆豉風味物質形成、營養成分變化、功能因子形成及抗氧化活性的影響作進一步的研究。